Scomposizione in domini e caratterizzazione dell'Annessina A11, proteina associata alla SLA

Annexins are well-known proteins able to bind membrane phospholipids and vesicles in a calcium- dependent manner. Mammals have 12 genes coding annexins (A1-A11 and A13). These proteins carry out a multitude of functions inside the organism. They play an important role in endocytosis, exocytosis, vesicles transport inside the cell and some of them are even known to carry out extracellular activities (A1, A2 and A5). Since their discovery, annexins have been associated to human diseases. Mutated annexins can, in fact, contribute to pathogenesis of autoimmune diseases, sarcoidosis and cancer (ovarian, gastric and colon-rectal cancer). Recently, Smith B. et al have identified new mutations of ANXA11 gene in patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ASL). This finding has reawakened the interest in Annexins A11. This protein is a member of annexins superfamily, but it shows some differences compared to the others. It is characterised by the longest N-terminal domain in the annexins class (196 amino acids). It is especially composed by glycine, proline and tyrosine, which confer an unstructured conformation to A11. This composition has made impossible the structural determination of A11 with X-rays. In addition to N-terminal domain, A11 has the characteristic annexin domain, the C-terminal domain (core). This fragment is composed by 4 repeated regions, which are able to bind calcium ions and membrane phospholipids. The aim of this work was to express, purify and characterise structurally the human A11wt single domains and focus on possible differences with long mouse A11wt analysed in the study conducted by Lecona et al. In particular, purification of single domain (bind with a His tag) was difficult because of low solubility of protein in solution. Purification of N-terminal domain was improved reducing the salt concentration in the buffer, maybe because of a possible salting-out of the protein. Instead, the adding of EDTA in C-terminal domain purification has stabilized it in solution and decreased the domain aggregation induced by calcium ions. Subsequently, domains were analysed with circular dichroism (CD). N-terminal domain shows a secondary structure prevalently composed by random coil, while C-terminal domain by α-helices. The addition of calcium salt doesn't increase the percentage of α-helix in the structure of C-terminal domain like in the long mouse A11wt, but it plays a stabilising role of three-dimensional structure of the protein. In presence of calcium, an increment of 14°C in the temperature of melting (Tm) was shown, during the thermal unfolding registration. After structural characterisation, it was performed the functional characterisation. It is known, for some annexins, that there is an important interaction between C-terminal and N-terminal domains, which plays an essential regulative role. Thus, it was analysed the possible interaction between the two domains of Annexin A11 performing a cross-linking assay. Results suggest that there is a weak interaction between these two domains.

Le annessine sono proteine caratterizzate dalla capacità di legare i fosfolipidi di membrane e vescicole in maniera dipendente dal calcio. I mammiferi possiedono 12 annessine (A1-A11 e A13). Queste proteine svolgono una moltitudine di funzioni all'interno dell'organismo. Rendono possibili processi come l'endocitosi, l'esocitosi, il trasporto di vescicole all'interno della cellula e sono persino in grado di svolgere attività extracellulari (A1, A2 e A5). Sin dalla loro scoperta, le annessine sono state associate ad alcune malattie dell'essere umano. Loro mutazioni possono infatti causare o contribuire alla patogenesi di malattie autoimmuni, sarcoidosi e cancro (ovaie, gastrico e colon-retto). Recentemente, Smith B. et al hanno identificato nuove mutazioni del gene ANXA11 in pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA). Questa scoperta ha riacceso l'interesse verso l'annessina A11. Quest'ultima, infatti, è un membro della famiglia delle annessine, ma si distingue dalle altre. È caratterizzata dal dominio N-terminale più lungo di questa classe (196 amminoacidi). Esso è formato prevalentemente da glicine, proline e tirosine che gli conferiscono una forma disordinata e hanno reso impossibile determinare la struttura tridimensionale di A11 utilizzando i raggi X. Oltre al dominio N-terminale, A11 possiede il dominio caratteristico delle annessine, ovvero il C-terminale (core), composto da 4 regioni ripetute capaci di legare il calcio e i fosfolipidi di membrana. Lo scopo del seguente lavoro è stato quello di esprimere, purificare e caratterizzare strutturalmente i domini separati dell'annessina A11wt umana, concentrandosi sulle possibili differenze con l'A11wt murina intera analizzata nello studio condotto da Lecona et al. In particolare, la purificazione dei domini (ognuno legato ad un His tag) è stata caratterizzata da notevole difficoltà a renderli solubili in soluzione. La purificazione di N-terminale è stata migliorata riducendo il contenuto di sale nel buffer, a causa di un possibile salting-out della proteina. Invece, il C-terminale è stato stabilizzato dall'aggiunta dell'agente chelante EDTA, il quale riduce l'aggregazione del dominio indotta dal calcio presente in soluzione. Successivamente, si sono analizzati i domini utilizzando il dicroismo circolare (CD). N-terminale mostra una struttura secondaria prevalentemente caratterizzata da random coil, mentre C-terminale da α-eliche. L'aggiunta di calcio a quest'ultimo non ha incrementato la percentuale di α-elica come nella A11wt intera di topo, ma ha comunque svolto un'azione stabilizzante sulla struttura tridimensionale della proteina, come evidenziato dalla denaturazione termica e dall'aumento di 14°C della temperatura di fusione (Tm) del C-terminale in presenza di calcio. Alla caratterizzazione strutturale si è, poi, proceduto con la caratterizzazione funzionale. È noto che le annessine presentano un'importante interazione tra il C- e N-terminale che svolge un essenziale ruolo regolativo. Si è, quindi, analizzata la possibilità dell'interazione tra N-terminale e C-terminale anche per l'Annessina A11 attraverso il metodo del Cross-linking. I risultati suggeriscono una debole interazione tra questi due domini.