Colture di tenociti e espianti tendinei esposti a PEMF: una possibile strategia per migliorare lo sviluppo tenogenico? Uno studio in vitro

Aim of the study The aim of the study was to assess the expression of tenogenic markers in culture of tenocytes and evaluate the histology of tendon explant cultures after pulsed electromagnetic fields (PEMF) exposure, to establish a possible role of PEMF in the healing process of tendon lesion. Methods and Materials Tenocytes: Discarded fragments of semitendinosus and gracilis tendons were collected from 13 healthy donors who underwent ACL reconstruction. Tendon tissue was minced and digested enzymatically. The isolated nucleated cells were then plated in complete medium. When they reached 80-90% of confluence, the cells were detached and then cultured (for 7, 14, 21 days) at a density of 5x103 cells/ cm2 in chamber slides, to optimize the final immunofluorescence analysis. The following cell cultures were set up: - tenocyte cultures PEMF exposed 8 h/day; - tenocyte cultures without PEMF exposure. At day 7, 14 and day 21, immunofluorescence analysis was performed to evaluate the expression of collagen type I, collagen type VI, scleraxis, PCNA and beta-catenin. Tendon explant cultures: Discarded fragments of semitendinosus and gracilis tendons were collected from 4 healthy donors who underwent ACL reconstruction. The tendons samples were collected and immediately processed. The tendons were manually minced into fragments (1 cm length). The tendon fragments were incubated in a complete medium for tenocytes. The following cell cultures were set up: - tendon cultures PEMF exposed 8 h/day; - tendon cultures without PEMF exposure. After 21 days, the samples were paraffin embedded and cut with the microtome. Histologic evaluation consisted of haematoxylin/eosin staining. The histologic sections were then examined under light microscopy. A cell count was performed to quantify the number of tenocytes within the exposed and non-exposed cultures. Results Tenocytes: The tenocyte cultures under PEMF exposure showed greater production of collagen type I, collagen type VI and Scleraxis and the expression of these markers increased from 7 to 21 days of culture. The expression of beta-catenin and PCNA was significantly lower in the PEMF exposed tenocyte cultures. Tendon explant cultures: The histologic evaluation at day 21 didn't show a significant difference in cellular number between PEMF exposed cultures and non-PEMF exposed cultures. Conclusions The tenocytes within the autograft are alive and sensible to PEMF exposure that cause an increase of expression of specific tendon markers, although PEMF don't interact in tissue cellularity. These results suggest that magnetic fields can modify the phenotype of tendon cells by increasing specific tendon components expression, without any reduction of cells number. Thus PEMF become a possible tool to increase tendon healing and improve the integration process during reconstructive surgery. Other in vitro and in vivo studies may be the base for clinical application.

Obiettivi Valutare l'espressione di marker tenogenici in tenociti isolati e l'istologia di espianti tendinei esposti a PEMF, per stabilire un possibile ruolo dei PEMF nel favorire la guarigione di lesioni tendinee. Materiali e metodi Tenociti: Sono stati prelevati campioni di tendine gracile e semitendinoso da 13 donatori sani (durante ricostruzione di LCA). Il tessuto tendineo è stato frammentato e digerito enzimaticamente per isolare i tenociti. In seguito, i tenociti isolati sono stati coltivati in terreno completo. Infine, raggiunta la confluenza cellulare del 80-90%, le cellule sono state separate e successivamente coltivate per 7, 14 e 21 giorni. Sono stati allestiti due gruppi di colture cellulari: - tenociti in coltura esposte a PEMF per 8 ore al giorno; - tenociti in coltura senza esposizione a PEMF (coltura di controllo). A 7, 14, 21 giorni di coltura è stata effettuata un'analisi semi-quantitativa in immunofluorescenza per valutare e confrontare l'espressione delle proteine specifiche dei tenociti (collagene tipo I, collagene tipo VI e scleraxis) e delle proteine associate alla proliferazione e sopravvivenza cellulare (PCNA e beta-catenina). Espianti tendinei: Frammenti di tendine gracile e semitendinoso sono stati prelevati da 4 donatori sani (durante ricostruzione di LCA). I campioni di espianti tendinei sono stati raccolti e segmentati manualmente in frammenti di lunghezza 1 cm. I frammenti tendinei sono stati coltivati in terreno completo. Sono stati allestiti due gruppi di colture cellulari: - espianti tendinei in coltura esposte a PEMF per 8 ore al giorno. - espianti tendinee in coltura senza esposizione a PEMF (coltura di controllo). Dopo 21 giorni, i campioni sono stati inclusi in paraffina e sezionati con microtomo. È stata effettuata una colorazione ematossilina/eosina sui campioni e i campioni sono stati analizzati con l'utilizzo di un microscopio ottico. È stato eseguito il conteggio delle cellule per quantificare l'espansione dei tenociti all'interno degli espianti tendinei nelle colture esposte e non esposte a PEMF. Risultati Tenociti: I risultati dell'analisi in immunofluorescenza dell'espressione delle proteine specifiche delle cellule tenocitarie (collagene I, VI e scleraxis) mostrano che l'espressione è significativamente maggiore nei campioni esposti a PEMF rispetto alle colture di controllo. In particolare, vi è un aumento progressivo dei valori assoluti al crescere dei giorni di coltura nelle cellule esposte a PEMF. L'espressione della proteina beta-catenina e del PCNA è maggiore nelle colture non esposte a PEMF. Espianti tendinei: Non vi è un'alterazione della cellularità degli espianti tendinei nelle colture esposte a PEMF rispetto alle colture di controllo dopo 21 giorni di coltura. Conclusione I tenociti presenti negli autoinnesti tendinei sono vitali e i PEMF inducono in loro una maggiore sintesi di marker tenogenici rispetto ai controlli non esposti, senza alterare la cellularità degli autoinnesti. Questi risultati suggeriscono che i campi elettromagnetici determinano una modifica sul fenotipo cellulare, l'aumento dell'espressione di componenti propri dei tendini, senza influire sulla cellularità. In questo modo diventano un mezzo per facilitare la guarigione di lesioni tendinee e per favorire il processo di integrazione di innesti tendinei in caso di chirurgia ricostruttiva. Ulteriori studi in vitro e in vivo potranno confermare tale ruolo e porre le basi per l'applicazione clinica.