Tendine del gracile e semitendinoso per la ricostruzione del LCA: scaffold acellulare o trapianto tendineo sotto esposizione PEMF? Studio in vitro

Goals of the study Hamstring tendons represent one of the most common structures used as autograft during ACL reconstruction.The harvest of the tendon, the time of processing on the operating table, and the permanence out of the joint during the time of surgery, may impair tenocytes' viability. The aim of the study was to assess the effective viability of the tendon cells at the end of the surgical procedure and to investigate whether tenocyte viability and the expression of tenocyte markers may be improved by exposure to pulsed electromagnetic fields (PEMF). Methods and materials Remnants of semitendinosus and gracilis were collected from 13 healthy donors. Tendon tissue was minced and digested enzymatically with 0.3 % type I collagenase in DMEM with continuous agitation for 15 h at 37°C. The isolated nucleated cells were then plated at 5x103 cells/cm2 in complete medium, composed of: DMEM, 10 % fetal bovine serum, 50 U/ml Penicillin, 50 lg/ml Streptomycin, 2 mM L-glutamine, and supplemented with 5 ng/ml basic fibroblast growth factor (b-FGF). They were maintained at 37 °C within a humidified atmosphere with 5 % CO2, changing culture medium every 3 days. When they reached 80¿90 % of confluence, the cells were detached by incubation with trypsin/EDTA and then cultured at a density of 5x103 cells/cm2. TCs were cultured in complete medium for 7, 14, 21 days in chamber slides, to optimize the final immunofluorescence analysis. The following cell cultures were set up: - TCs cultured with differentiation medium and exposure to PEMF 8 h/day - TCs cultured with differentiation medium without exposure to PEMF The stimulation with PEMF was generated by a pair of electrical coils, connected with the generator of pulsed electromagnetic fields (PEMF generator system IGEA, Carpi, Italy, intensity of magnetic field = 1.5 mT, frequency = 75 Hz). At day 7, 14 and day 21, immunofluorescence analysis was performed to evaluate the expression of collagen type I, collagen type VI, scleraxis and PCNA. Results At any considered end point tendon cells were alive and they expressed markers of proliferation and tendon phenotype. The TCs in the presence PEMF showed greater production of collagen type I, collagen type VI and scleraxis (p<0.05) and the expression of this markers increased from 7 to 21 days of culture, the expression of PCNA was significantly lower (p<0,05). Conclusions Hamstring tendons used for ACL reconstruction are not simple autologous scaffold but a biologic structure, rich in viable cells. The use of PEMF may improve their phenotype and increase the expression of tendon markers as type I collagen, type VI collagen and scleraxis in a time dependent way. PEMF exposure can improve grafts' tenogenic phenotype, leading to a faster joint healing acting on early ligamentization phase. Clinical perspectives Therapeutical application in vivo,in patients undergoing ACL reconstruction to enhance clinical results in term of faster functional recovery, less pain and faster return to activity acting on grafts' osteointegration, early ligamentization phase and tenocytes phenotype. In vivo application to enhance healing and biomechanical resistance in partial ACL lesions. Moreover it will be useful in the future to define the best PEMF exposition protocols for an optimal treatment.

Obiettivi dello studio Gli obiettivi dello studio sono: stabilire se i tenociti siano vitali alla fine delle procedure chirurgiche, ed investigare se la vitalità e l'espressione di markers tenocitari possa essere migliorata grazie all'esposizione a campi elettromagnetici pulsanti (PEMF). Materiali e metodi Sono stati prelevati campioni tendinei di gracile e semitendinoso da 13 donatori sani. Il tessuto è stato ridotto in frammenti e digerito enzimaticamente con collagenasi di tipo I allo 0.3% in DMEM con agitazione continua per 15h alla temperatura di 37°C. Le cellule nucleate, sono state messe in coltura a 5x103 cellule/cm2 in un mezzo di coltura completo costituito da: DMEM, siero bovino fetale al 10%, 50 U/ml di penicillina, 50 mg/ml di streptomicina, 2mM di L-glutammina e supplementato con 5 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti b-FGF. Le colture cellulari sono state mantenute a 37°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 cambiando il mezzo di coltura ogni 3 giorni. Quando le colture hanno raggiunto la confluenza del 80-90%, le cellule sono state separate grazie all'incubazione con tripsina/EDTA e successivamente coltivate alla densità di 5x103 cellule/cm2. Le cellule tendinee sono quindi state coltivate in un mezzo di coltura completo per 7, 14 e 21 giorni in chamber slides per ottimizzare l'analisi finale in immunofluorescenza. Sono stati quindi creati due gruppi: -Tenociti in coltura con mezzo di differenziazione esposti a PEMF 8h\die. -Tenociti in coltura con mezzo di differenziazione senza esposizione a PEMF. L'esposizione a PEMF è stata generata da un paio di bobine elettriche, connesse ad un generatore di onde elettromagnetiche pulsanti (PEMF generator system IGEA, Carpi, Italy) all'intensità di 1.5mT e frequenza di 75 Hz. Sui due gruppi sono state eseguite analisi con IF ai giorni 7, 14 e 21 per valutare l'espressione di collagene di tipo I, collagene di tipo VI, scleraxis e PCNA. Risultati Le cellule tendinee si sono dimostrate vive ad ogni end-point considerato, ed esprimono markers di proliferazione e un fenotipo tendineo. I tenociti esposti a PEMF hanno dimostrato una maggior espressione di collagene di tipo I, collagene di tipo VI e scleraxis (p<0.05) in modo tempo-dipendente al giorno a 7, 14 e 21 giorni ed una minor espressione di PCNA (p<0.05). Conclusioni I campioni tendinei non sono scaffold acellulari ma strutture vitali e ricche di cellule. L'esposizione a PEMF può migliorare il fenotipo delle cellule tendinee ed aumentare la loro espressione di markers tendinei come collagene di tipo I, collagene tipo VI e scleraxis in modo tempo dipendente. L'esposizione a PEMF può migliorare l'espressione di aspetti tenogenici del graft potendo portare ad un più rapido recupero della funzionalità articolare agendo sulla fase precoce di legamentizzazione. Prospettive cliniche Applicazioni terapeutiche in vivo su pazienti sottoposti a ricostruzione di LCA per migliorare il risultato clinico in termini di più rapido recupero funzionale, diminuzione del dolore e più rapido ritorno all'attività agendo sulla osteointegrazione del graft, sulla fase precoce di legamentizzazione e sul fenotipo dei tenociti. Applicazioni in vivo per promuovere la guarigione e la resistenza biomeccanica di lesioni parziali di LCA. Sarà inoltre utile andare a definire quali siano i migliori protocolli di esposizione a PEMF per un trattamento ottimale.