EFFETTO DELLE VESCICOLE EXTRACELLULARI CIRCOLANTI SULLA NEOANGIOGENESI IN PAZIENTI CON MALATTIE CARDIOVASCOLARI

Diabetes and obesity are pathological conditions that significantly increased the risk of cardiovascular events. The abnormal development of new vessels has been described associated with diabetes and obesity. Moreover, the presence of endothelium dysfunction, a common feature in these settings, requires more efficient mechanisms of vascular remodeling. Although current therapeutic approaches have improved patients' quality of life in these specific clinical settings, so far, no efficient therapeutic options have been yet proposed to improve vascular remodeling. This has spurred the scientific community to propose alternative approaches including adult stem cells for tissue regeneration purposes. Recently extracellular vesicles (EV) derived from stem cells and serum have attracted particular attention for both their regenerative properties and proangiogenic capacity. Our research team have previously demonstrated that serum-derived EV obtained from healthy donors can promote angiogenesis in vivo in a mouse model of critical limb ischemia (Cavallari et al. SciRep.2017). The aim of the present study was to evaluate the therapeutic potential of EV isolated from patients with high risk of cardiovascular events. Diabetic, diabetic/obese, obese and ischemic patients have been selectively recruited and EV from these patients analyzed. The recruitment of these groups of patients have been based on the hypothesis that such patients are those who could benefit from autologous EV administration. First, we performed an in vitro assay, previously validated, that can predict EV angiogenic potential in vivo. We have proven that EV from patients with high cardiovascular risk, like those of healthy subjects, could be divided in two categories: the effective and ineffective based on the in vitro potency test. Even in this case, the in vitro assay was able to predict the efficacy in vivo in a mouse model of angiogenesis. To better understand the mechanism associated with EV biological effects we compared effective and ineffective EV miRNA cargo by starting from healthy subjects. We identified 8 miRNAs differentially expressed in effective and ineffective EV. Among the identified miRNAs, miR-130a showed a correlation with EV proangiogenic capability not only in healthy subject but also in patients. IPA ingenuity analysis demonstrated that the TGF signaling pathway is one of the most important miR-130a interactome. Indeed, the TGF ELISA assay performed on EV derived from our patients proved that TGF EV content can be considered a reliable marker of EV proangiogenic activity. In order to assess whether miR-130a and TGF EV content could represent a reliable tool to select patients with effective EV, to be used for autologous therapy, a ROC curve was developed. The ROC curve analysis demonstrated that alone both miR-130a and TGF can be considered good predictors of ¿Non Responders¿; moreover, the same data analyzed in series was able to demonstrate an increase of specificity (75% vs 50%) of the test. This provides the rational to use these biological assays to indirectly select EV functionally effective in promoting angiogenesis. Overall, in this study we identified EV miR-130a and TGF content as potential biomarkers of ineffective EV in patients with cardiovascular risk factors. Therefore, these results provide the rational to use such easy and suitable assays to predict autologous EV effectiveness in patients requiring alternative therapeutic options

Diabete e obesità sono condizioni patologiche che aumentano significativamente il rischio di andare incontro a eventi di tipo cardiovascolare. Un'alterata formazione di vasi è stata descritta associata a patologie come diabete e obesità. Sebbene le attuali opzioni terapeutiche siano migliorate, non esistono ad oggi terapie capaci di esercitare effetti benefici sulla disfunzione endoteliale e sul rimodellamento vascolare. Più recentemente un interesse particolare è stato rivolto alle vescicole extracellulari (EV) presenti nel siero per le loro proprietà rigenerative e proangiogeniche. È stato infatti dimostrato dal nostro gruppo di ricerca (Cavallari et al. SciRep.2017) che le EV circolanti ottenute dai soggetti sani possono promuovere angiogenesi in vivo in un modello di ischemia dell'arto inferiore. In questo studio è stata analizzata la capacità angiogenica delle EV ottenute dal siero di pazienti con rischio cardiovascolare, cioè coloro che potrebbero utilizzare le EV a scopo terapeutico. Per questo abbiamo utilizzando un saggio in vitro capace di predire l'efficacia in vivo. La popolazione in studio comprende soggetti sani, diabetici, obesi, obesi/diabetici e con ischemia critica degli arti inferiori. Abbiamo dimostrato che anche le EV sieriche recuperate dai pazienti appartenenti ai diversi gruppi di studio potevano essere distinte in efficaci e inefficaci sulla base del test di potenza in vitro e anche in questo caso il saggio in vitro era in grado di predire l'efficacia delle EV in vivo nell'animale. Per comprendere i meccanismi responsabili degli effetti biologici delle EV sieriche abbiamo effettuato un'analisi dei miRNA contenuti nelle EV effettive e ineffettive. Abbiamo identificato nei soggetti sani 8 miRNA differenzialmente espressi nelle EV con attività biologica differente. Tra questi, il miR-130a è risultato essere quello con diversa distribuzione tra i due gruppi. Mediante analisi bioinformatica di miR-130a, siamo riusciti a dimostrare un ruolo di interattore di TGFβ. A conferma di ciò un saggio ELISA per il dosaggio di TGFβ effettuato su tutti i soggetti ha dimostrato che anche la concentrazione di TGFβ nelle EV sieriche può essere un valido marcatore delle capacità proangiogeniche delle EV. Al fine di verificare se questi due saggi (contenuto di miR-130a e TGFβ nelle EV) potessero rappresentare un utile strumento per selezionare quei pazienti che potrebbero utilizzare in modo autologo le EV recuperate dal siero per scopi terapeutici, abbiamo eseguito una analisi mediante curva ROC: questa ha dimostrato che sia miR-130a che TGFβ possono essere ritenuti buoni predittori. In particolare questi saggi consentono di identificare soggetti ¿Non Responders¿ (le cui EV sieriche non hanno proprietà angiogeniche). La combinazione in serie dei due test, che prendevano in considerazione i dati relativi al contenuto di miR-130a e TGFβ nelle EV ha mostrato un aumento della specificità (75%) ed una buona sensibilità (84%) dei test. I risultati dello studio dimostrano quindi che stabilire a priori l'efficacia delle EV è fondamentale anche nei pazienti con elevato rischio di malattia cardiovascolare. Abbiamo inoltre messo a punto un saggio semplice ma sensibile e specifico, basato sui profili di espressione di TGFβ e miR-130a nelle EV, che permette di identificare i veri ¿Non Responders¿. Ciò potrebbe favorire l'uso in ambito clinico delle EV sieriche autologhe nei pazienti per i quali siano richiesti processi di rigenerazione vascolare.