Strategie innovative per la veicolazione della pentamidina nei liposomi per la terapia antitumorale: esperienza con la pentamidina citrato.

During the past two decade, nanomedicine and nanotechnology have greatly improved, leading to an increasing interest in drug delivery systems able to target drugs to specific parts of the body. Such systems, include organic delivery systems that have exhibited good properties in desease treatment and diagnosis. For instance, liposomes1 have proved biocompatible because they are part of cellular membranes and are able to target hydrophilic, hydrophobic and amphiphilic drugs. Pentamidine is an antitumoural drug, its mechanism2 appears multi-factorial given: it inhibits endonuclease and esonuclease; the pentamidine-S100B complex (S100B belongs to a protein family involved in cellular proliferation and differentiation and, especially, in the down-regulation of p53) prevents the binding between p53 ( a transcriptional activator that regulates cellular cycle and apoptosis) and S100B reactivating p53's normal functions. Such a drug proved effective when administered intravenus although it caused severe renal toxicity. My thesis focuses on targeting with liposomes in order to decrease side effects. A so far unreported encapsulation was used. Preparation techniques of the liposomial formulation were varied and the formulation that offered the best encapsulation percentage was characterized and studied in depth. Different parameters were evaluated: concentration of encapsulated pentamidine, lipid concentration, liposomial particle diameter, Z potential and cryoTEM analysis. Stability was evaluated: the formulation was stable in storage conditions at 4°C for a month, at 37°C in a pH=7.4 buffer a release of pentamidine was observed (7 % after 24 h and 14 % after 72 h). Results underlined a controlled release of the drug. It was impossible to evaluate the stability in serum at 37°C because of the its absorption at the same wave length of pentamidine. In future the amount of the released drug's will be evaluated in serum at 37°C using an HPLC analysis that separated the drug and serum components. In vitro tests to evaluate the cytotoxicity of pentamidine liposomial formulation were performed in human ovarian carcinoma cells (A2780) and in human breast adenocarcinoma cells (MDA-MB-231), and contrasted to free pentamidine. Again liposomes were seen to be the drug delivery system. In conclusion, the technique used for the preparation of liposomial formulation enable us to obtain an encapsulation efficiency of pentamidine in the liposomes better than previous literature's works. (1) Sharma A., Sharma U.S., Liposomes in drug delivery: progress and limitations, International Journal of Pharmaceutics (1997), 123-140. (2) J. Mérian et al., Development of a liposome formulation for improved biodistribution and tumor accumulation of pentamidine for oncology applications, International Journal of Pharmaceutics (2015), 154-164.

Negli ultimi due decenni, la nanomedicina e le nanotecnologie hanno avuto un rapido sviluppo, portando ad un aumento di interesse nei confronti dei sistemi di drug delivery capaci di direzionare il farmaco verso gli organi bersaglio in modo selettivo. Tra questi, i sistemi di veicolazione di natura organica sono dei buoni carriers sia in ambito terapeutico che diagnostico. I liposomi1, ad esempio, sono biocompatibili, in quanto costituiti da componenti delle membrane cellulari e capaci di veicolare farmaci sia idrofili, sia lipofili, sia anfifilici. La pentamidina è un farmaco ad attività antitumorale, il cui meccanismo d'azione2 appare essere multifattoriale: inibisce le endonucleasi e le esonucleasi ed il complesso pentamidina-S100B (S100B appartiene ad una famiglia di proteine coinvolte nella proliferazione e differenziazione cellulare e, in particolare, nella down-regulation di p53) impedisce il legame di p53 (un attivatore della trascrizione che regola il ciclo cellulare e l'apoptosi) a S100B ripristinando le normali funzioni di p53. Questo farmaco è efficace attraverso la via di somministrazione endovenosa, ma presenta un importante effetto collaterale di nefrotossicità. In questo lavoro di tesi si è pensato di direzionare il farmaco, incapsulandolo nei liposomi per diminuirne gli effetti collaterali. È stata utilizzata una tecnica di incapsulazione del farmaco non riportata finora in letteratura per la pentamidina. Sono state variate molteplici condizioni nella preparazione della formulazione liposomiale ed è stata caratterizzata in maniera approfondita la formulazione che ha permesso di ottenere la migliore percentuale di incapsulazione. Sono stati valutati differenti parametri quali: la concentrazione di pentamidina incapsulata, la concentrazione di lipidi, il diametro delle particelle liposomiali, il potenziale Z e l'analisi cryotem. Si è, inoltre, valutata la stabilità: la formulazione è stabile in condizioni di stoccaggio a 4°C per un mese, mentre a 37°C in tampone a pH= 7.4 si osserva un rilascio di pentamidina (7 % dopo 24 ore e 14 % dopo 72 ore). I risultati delle prove effettuate hanno evidenziato l'esistenza di un effettivo rilascio controllato del farmaco. Non è stato possibile valutare la stabilità in siero a 37°C a causa dell'assorbimento di alcune componenti del siero alla stessa lunghezza d'onda della pentamidina. In futuro si valuterà la quantità di farmaco rilasciato in siero a 37°C attraverso un'analisi HPLC che permetta la separazione del farmaco dalle componenti del siero che causano l'interferenza. Sono stati effettuati dei test in vitro per valutare la citotossicità della formulazione liposomiale di pentamidina in cellule di carcinoma ovarico (A2780) e in cellule di adenocarcinoma mammario (MDA-MB-231), confrontandola con la pentamidina libera, anche in questo caso è possibile osservare come i liposomi si comportino da sistema a rilascio modificato del farmaco. In conclusione, la metodica utilizzata nella preparazione della formulazione liposomiale ha permesso di ottenere un'efficienza di incapsulazione della pentamidina nei liposomi maggiore dei precedenti dati riportati in letteratura. (1) Sharma A., Sharma U.S., Liposomes in drug delivery: progress and limitations, International Journal of Pharmaceutics (1997), 123-140. (2) J. Mérian et al., Development of a liposome formulation for improved biodistribution and tumor accumulation of pentamidine for oncology applications, International Journal of Pharmaceutics (2015), 154-164.