Effetto di antiinfiammatori non steroidei su linee cellulari di tumore del colonretto: correlazione con mutazioni di PI3K

Phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) are enzymes capable of transferring a phosphate to position 3' of inositol and this lead to phosphoinositide development: phosphoinositide are involved in several cellular processes, including proliferation, survival, glucose transport, cytoskeleton organization and platelet activities. Mutations on PI3K signaling pathway are implied in oncogenic development1: mutation on PI3K3CA gene (observed in 15-20% colorectal cancers) leads to PI3K signaling pathway dis-regulation, enhancing cyclo-oxygenase (COX-2) activity, that results in PGE2 increase synthesis. This process results in apoptosis inhibition of malignant cells2. Several studies demonstrate that aspirin (nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID) exploit its inhibitory mechanism over COX-2, leading to anti-proliferative and anti-apoptotic effects increasing patients survival with PI3K3CA-mutated cancers3. Within NSAIDs there is indomethacin, a non-selective COX anti-inflammatory drug, which shows in several studies an antiproliferative effect in vitro by using low doses (10-20 microM)4. Previous studies highlighted how indomethacin antiproliferative effect was stronger in epidermal breast cells with H1047R-mutation on PI3K3CA gene than wild-type cells5. This thesis evaluated if this mutation influences drug response also in colorectal tumor cellular lines, comparing indomethacin with other NSAIDs with different affinity for the two COX isoforms. CellTiter-Glo® Assay (Promega) was used to evaluate cell proliferation. In colorectal cancer cell lines the mutation PI3K H1047R mutation is correlated with indomethacin sensitivity, while the other NSAIDs antiproliferative effect is not mutation-correlated.Therefore, we evaluated indomethacin ability to modify the activation of Akt, a PI3K down-stream protein, and of MAPKs, a parallel PI3K signaling pathway, highlighting a cell dependent modulation. 1) Engelman J.A. ¿Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations.¿ Nature 2009: 552 2) Liao X, Lochhead P, Nishihara R, Morikawa T, Kuchiba A, Yamauchi M, Imamura Y, Qian Z.R, Baba Y, Shima K, Sun R, Nosho K, Meyerhardt J.A, Giovannucci E, Fuchs C.S, Chan A.T, Ogino S ¿Aspirin Use, Tumor PIK3CA Mutation, and Colorectal-Cancer Survival¿ N Engl J Med 2012; 367; 1596-606. 3) Ogino S, Lochhead P, Giovannucci E, Meyerhardt J.A, Fuchs C.S, Chan AT ¿Discovery of colorectal cancer PIK3CA mutation as potential predictive biomarker: power and promise of molecular pathological epidemiology¿ Oncogene 2014; 33, 2949¿2955 4) Eli Y, Przedecki F, Levin G, Kariv N, Raz A ¿Comparative effects of indomethacin on cell proliferation and cell cycle progression in tumor cells grown in vitro and in vivo.¿ Biochem Pharmacol; 2001; 61(5):565-71 5) Di Nicolantonio F, Arena S, Gallicchio M, Zecchin D, Martini M, Flonta S.E, Stella G.M, Lamba S, Cancelliere C, Russo M, Geuna M, Appendino G, Fantozzi R, Medico E, Bardelli A ¿Replacement of normal with mutant alleles in the genome of normal human cells unveils mutation-specific drug responses¿ PNAS; 2008; Vol.105; no. 52

Le fosfoinositidi-3-chinasi (PI3Ks) sono enzimi in grado di trasferire il gruppo ¿OH in posizione 3' del fosfoinositolo portando alla formazione di fosfoinositidi, elementi coinvolti in processi cellulari quali proliferazione, sopravvivenza, organizzazione del citoscheletro, trasporto del glucosio e attività delle piastrine. Mutazioni a livello della via di segnale sono implicati nello sviluppo canceroso1: la mutazione del gene PI3K3CA (che si riscontra nel 15-20% dei tumori al colon-retto) porta alla sovra regolazione della via di segnale di PI3K, potenziando l'attività della ciclossigenasi-2 (COX-2) con conseguente aumento della sintesi di PGE2, che si traduce nell'inibizione del processo di apoptosi nelle cellule tumorali2. Diversi studi hanno dimostrato che l'aspirina, farmaco antiinfiammatorio non steroideo (FANS), sfruttando il suo meccanismo inibitorio sulle COX, ha un effetto antiproliferativo e anti-apoptotico con aumento della sopravvivenza di pazienti con PI3K3CA mutato3. Tra i FANS con potenziale effetto protettivo c'è l'indometacina, antiinfiammatorio non selettivo per le COX, per la quale in diversi studi in vitro è stato dimostrato un effetto antiproliferativo con riduzione della vitalità cellulare a basse dosi (10-20 microM)4. Studi precedenti hanno evidenziato come l'effetto antiproliferativo dell'indometacina sia più marcato in cellule di epitelio della mammella recanti la mutazione H1047R a carico del gene PIK3CA rispetto alle cellule wild-type5. In questa tesi si è quindi voluto valutare se tale mutazione condizioni la risposta al farmaco anche in un pannello di linee cellulari di tumore del colon-retto, confrontando l'indometacina ad altri antiinfiammatori non steroidei, aventi diversa affinità per le due isoforme delle COX. Per valutare la proliferazione cellulare è stato utilizzato il saggio di luminescenza CellTiter-Glo® Assay (Promega). Anche nelle linee cellulari di tumore del colon retto sembra esserci una correlazione tra la presenza della mutazione H1047R e una maggiore sensibilità all'indometacina, mentre gli altri antinfiammatori non inibiscono in maniera mutazione-relata la proliferazione cellulare. Inoltre è stata valutata la capacità dell'indometacina di modificare l'attivazione di AKT, proteina a valle di PI3K, e delle MAPK, via di segnale parallela a quella di PI3K, mediante saggi di western blot, evidenziando come vi sia una modulazione di tali proteine differente nelle singole linee cellulari. 1) Engelman J.A. ¿Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations.¿ Nature 2009: 552 2) Liao X, Lochhead P, Nishihara R, Morikawa T, Kuchiba A, Yamauchi M, Imamura Y, Qian Z.R, Baba Y, Shima K, Sun R, Nosho K, Meyerhardt J.A, Giovannucci E, Fuchs C.S, Chan A.T, Ogino S ¿Aspirin Use, Tumor PIK3CA Mutation, and Colorectal-Cancer Survival¿ N Engl J Med 2012; 367; 1596-606. 3) Ogino S, Lochhead P, Giovannucci E, Meyerhardt J.A, Fuchs C.S, Chan AT ¿Discovery of colorectal cancer PIK3CA mutation as potential predictive biomarker: power and promise of molecular pathological epidemiology¿ Oncogene 2014; 33, 2949¿2955 4) Eli Y, Przedecki F, Levin G, Kariv N, Raz A ¿Comparative effects of indomethacin on cell proliferation and cell cycle progression in tumor cells grown in vitro and in vivo.¿ Biochem Pharmacol; 2001; 61(5):565-71 5) Di Nicolantonio F, Arena S, Gallicchio M, Zecchin D, Martini M, Flonta S.E, Stella G.M, Lamba S, Cancelliere C, Russo M, Geuna M, Appendino G, Fantozzi R, Me