GPR21 e insulino resistenza: il suo ruolo nei macrofagi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a growing metabolic disorder, characterized by chronic hyperglycaemia, relative insulin deficiency, caused by pancreatic β-cell dysfunction, and insulin resistance in target organs [1]. Despite the many therapies available, many patients fail to achieve glycaemic control, making it necessary to identify new pharmacological strategies. GPR21 is an orphan and costitutively active receptor belonging to the superfamily of Gprotein coupled receptors (GPCRs) [2], for which a role in the etiopathogenesis of insulin resistance has been recently proposed. In particular, studies realized in GPR21 knock-out mice suggested that GPR21 may act by stimulating macrophages tissue migration and thus reducing insulin sensitivity [3]. The aim of this thesis was to study the effect of the pharmacological inhibition of GPR21 by using the GRA2 inverse agonist in human macrophages. For this purpose, the expression of the receptor in THP-1 cells differentiated in macrophages has been evaluated through Real TimePCR and Western Blot, demonstrating his presence and also highlighting an increase in its expression in proinflammatory macrophages M1. The functional analysis of the receptor, through the IP One HTRF assay, confirmed that GPR21 is also constitutionally active in our cellular model and that GRA2 acts as an inverse agonist reducing endogenous basal production of IP1. The analysis of migratory ability highlighted an opposite effect of GRA2 on M1 and M2 macrophages. Specifically, GRA2 significantly reduced the M1 (LPS + IFN-γ) macrophages migration, while induced a marked increase of the migration of M2 (IL-4 + IL-13). The result achieved on M1 macrophages was confirmed when migration assay has been reproduced on primary macrophages. Finally, from the analysis of the effect of GRA2 on cytokines release, it has revealed that the inverse agonist significantly reduces the release of TNF-α in M1 macrophages. These results indicate an active role of GPR21 in the inflammatory process mediated by macrophages, both in migration and in proinflammatory cytokines production. Moreover, they show that the inverse agonist is able to significantly reduce the effect of the receptor, suggesting that pharmacological inhibition of GPR21 can be a promising strategy which deserves further studies.

Il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) è un disturbo metabolico in continua espansione, caratterizzato da iperglicemia cronica, da una mancanza relativa dell'insulina, causata da disfunzione delle cellule beta pancreatiche, e da insulino resistenza negli organi target per l'azione dell'ormone [1]. Nonostante le numerose terapie disponibili, molti pazienti non riescono a raggiungere il controllo glicemico, rendendo necessaria l'individuazione di nuove strategie farmacologiche. GPR21 è un recettore orfano e costitutivamente attivo appartenente alla superfamiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCRs) [2], per cui è stato recentemente proposto un ruolo nell'eziopatogenesi dell'insulino resistenza. In particolare, studi effettuati in topi knock-out per questo recettore hanno suggerito che GPR21 possa agire stimolando la migrazione tissutale dei macrofagi e in questo modo ridurre l'insulino sensibilità [3]. Lo scopo di questa tesi è stato quello di studiare l'effetto dell'inibizione farmacologica di GPR21 attraverso l'uso dell'agonista inverso GRA2 a livello dei macrofagi umani. A tal scopo è stata valutata l'espressione del recettore in cellule THP-1 differenziate in macrofagi tramite Real Time-PCR e Western Blot, dimostrando la sua presenza e mettendo inoltre in evidenza un aumento della sua espressione nei macrofagi proinfiammatori M1. L'analisi funzionale del recettore, attraverso il saggio IP One HTRF, ha confermato che GPR21 è costitutivamente attivo anche nel nostro modello cellulare e che GRA2 agisce da agonista inverso riducendo la produzione endogena basale di IP1. L'analisi della capacità migratoria ha messo in evidenza un effetto opposto di GRA2 sui macrofagi M1 e M2. Nello specifico GRA2 ha ridotto significativamente la migrazione dei macrofagi M1 (LPS + IFN-γ), mentre nei macrofagi M2 (IL-4 + IL-13) ne ha indotto un marcato aumento. Questo esperimento, riprodotto anche su macrofagi primari, ha permesso di confermare l'effetto inibitorio di GRA2 sui macrofagi M1 (LPS + IFN-γ). Infine, dall'analisi dell'effetto di GRA2 sul rilascio di citochine è emerso che l'agonista inverso riduce significativamente il rilascio di TNF-α nei macrofagi M1. Questi risultati nel loro complesso indicano un ruolo attivo di GPR21 nel processo infiammatorio mediato dai macrofagi, sia per quanto riguarda la migrazione che la produzione di citochine proinfammatorie. Inoltre, dimostrano che l'agonista inverso è in grado di ridurre significativamente l'effetto del recettore, suggerendo che l'inibizione farmacologica di GPR21 può essere una strategia promettente che merita quindi ulteriori approfondimenti.