Ischemia/reperfusion injury is a pathological condition caracterized by a myocardial lacking oxigen distribution due to a narrowing of the coronary arteries (1), which is followed by the restoration of blood flow with the consequent development of the inflammatory response (2). Recent studies provide evidence about the key role of the multi-proteic complex NLRP3 in mediating the myocardial IR damage and modulating the Reperfusion Injury Salvage Kinase pathway, survival protein kinases known for their cardioprotective action (3). Intracellular and extracellular danger signals activate NLRP3, a cytosolic innate immune receptor, which is able to create a multi-proteic complex with ASC and caspase-1 causing the increase of IL-1β levels, that is responsible for initiating a cascade of inflammatory events. The aim of this thesis was to investigate the potential protective effects of NLRP3 inflammasome pharmacological modulation through the administration of a new synthesized selective inhibitor INF4E in an ex vivo model of myocardial IR injury. Male Wistar Rats 5-6 months old were sacrificed to excise their hearts, which were subjected to 30 minutes of ischemia, followed by a phase of 20-60 minutes of reperfusion, with or without the pharmacological pre-treatment. The results demonstrated that the administration of the compound INF4E (50µM 20 minutes before the ischemia period) induced a significant reduction of the infarct size and lactate dehydrogenase levels. Western Blot analysis on homogenates obtained from the apical portion of hearts revealed that IR evoked the NLRP3 proteic complex formation. Notably, INF4E administration resulted in significant time-dependent reduction of its expression and activity, as showed by changes in NLRP3, caspase-1 and Gasdermin levels. A decrease of IL-1β expression was identified through ELISA in pre-treated groups. In Western Blot analysis made to evaluate the modulation of selective markers of the RISK pathway, increased expression and activity of phERK, phAKT and phGSK-3β were recorded in pre-treated hearts. Moreover, this study analized mitochondrial biogenesis markers through WB and an increase of MtTFA, NRF-1 and sMtCK levels was recorded after the INF4E administration. Data here reported demonstrate for the first time that INF4E exerted protective role against the myocardial IR injury, by inhibition of the NLRP3 inflammasome, leading to the activation of the protective RISK pathway and improvement of mitochondrial functions. 1) S.Toldo, E.Mezzaroma, A. G.Mauro, F.Salloum, B.W.Van Tassell and A.Abbate. The Inflammasome in Myocardial Injury and Cardiac Remodeling. Antioxidants & Redox Signaling. 2014; Volume 00; 000¿000 2) Christopher B. Fordyce, Bernard J. Gersh, Gregg W. Stone, and Christopher B. Granger. Novel therapeutics in myocardial infarction: targeting microvascular dysfunction and reperfusion injury. Trends in Pharmacological Sciences. 2015; Volume 36; 605-616
Il danno da ischemia/riperfusione è una condizione che si verifica quando al danno dovuto a una scarsa distribuzione di ossigeno a livello del miocardio, a seguito di un restringimento delle coronarie (1), segue il ripristino del flusso ematico, determinando anche l'insorgenza di una risposta di tipo infiammatorio (2). Recenti studi documentano un ruolo chiave del complesso proteico NLRP3 nel mediare il danno infiammatorio di tipo ischemico e nella modulazione della via di segnale cardioprotettiva RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase), un gruppo di proteine chinasi. NLRP3 è un recettore citosolico dell'immunità innata che si attiva in risposta a segnali di pericolo intra ed extracellulari, formando un complesso multiproteico con ASC e con la caspasi-1 che determina l'incremento dei livelli di IL-1β, citochina iniziatrice della cascata di eventi infiammatori . Scopo del presente progetto di tesi è stato quello di indagare i potenziali effetti protettivi della modulazione farmacologica dell'inflammasoma NLRP3 attraverso la somministrazione di un inibitore selettivo di nuova sintesi INF4E in un modello sperimentale ex vivo di danno da IR. Per la sperimentazione sono stati utilizzati ratti maschi Wistar di 5-6 mesi, i cui cuori sono stati asportati, sottoposti a 30 minuti di ischemia, seguita da una fase di riperfusione della durata di 20-60 minuti, in presenza o in assenza di dell'inibitore farmacologico. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la somministrazione di INF4E (50µM 20 minuti prima dell'ischemia) ha indotto una riduzione significativa dell'area infartuata e dei livelli di LDH. Le analisi di Western Blot eseguite sugli estratti proteici delle porzioni apicali dei cuori hanno dimostrato che l'IR ha causato la formazione del complesso proteico NLRP3, ma in presenza del trattamento farmacologico la sua espressione ed attività sono state ridotte in maniera tempo-dipendente, come documentato dalle variazioni dei livelli delle proteine NLRP3, caspasi-1 e Gasdermin. Il saggio ELISA, inoltre, ha permesso di identificare una riduzione dell'espressione di IL-1β. Nelle analisi di WB effettuate per valutare la modulazione dei componenti della via RISK è stato evidenziato un aumento dell'espressione e dell'attività di phERK, phAKT e phGSK-3β nei cuori pretrattati con INF4E. E' stata anche valutata l'espressione dei markers della biogenesi mitocondriale e si è riscontrato un incremento dei livelli di MtTFA, del fattore nucleare NRF-1 e della proteina chinasi sMtCK a seguito del pretrattamento con INF4E. I dati raccolti in questa tesi dimostrano per la prima volta che INF4E ha un ruolo protettivo contro il danno IR del miocardio, attraverso una serie di processi che comprendono l'inibizione di NLRP3, l'attivazione della via protettiva RISK e il miglioramento delle funzioni mitocondriali. 1)S.Toldo et al. The Inflammasome in Myocardial Injury and Cardiac Remodeling. Antioxidants & Redox Signaling.2014;Vol00;000¿000 2)C.B.Fordyce et al. Novel therapeutics in myocardial infarction: targeting microvascular dysfunction and reperfusion injury. Trends in Pharmacological Sciences.2015;Vol36;605-616
Effetti indotti dalla modulazione farmacologica dell'inflammasoma NLRP3 in un modello di ischemia/riperfusione cardiaca
RUBICONDO, OMBRETTA
2016/2017
Abstract
Il danno da ischemia/riperfusione è una condizione che si verifica quando al danno dovuto a una scarsa distribuzione di ossigeno a livello del miocardio, a seguito di un restringimento delle coronarie (1), segue il ripristino del flusso ematico, determinando anche l'insorgenza di una risposta di tipo infiammatorio (2). Recenti studi documentano un ruolo chiave del complesso proteico NLRP3 nel mediare il danno infiammatorio di tipo ischemico e nella modulazione della via di segnale cardioprotettiva RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase), un gruppo di proteine chinasi. NLRP3 è un recettore citosolico dell'immunità innata che si attiva in risposta a segnali di pericolo intra ed extracellulari, formando un complesso multiproteico con ASC e con la caspasi-1 che determina l'incremento dei livelli di IL-1β, citochina iniziatrice della cascata di eventi infiammatori . Scopo del presente progetto di tesi è stato quello di indagare i potenziali effetti protettivi della modulazione farmacologica dell'inflammasoma NLRP3 attraverso la somministrazione di un inibitore selettivo di nuova sintesi INF4E in un modello sperimentale ex vivo di danno da IR. Per la sperimentazione sono stati utilizzati ratti maschi Wistar di 5-6 mesi, i cui cuori sono stati asportati, sottoposti a 30 minuti di ischemia, seguita da una fase di riperfusione della durata di 20-60 minuti, in presenza o in assenza di dell'inibitore farmacologico. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la somministrazione di INF4E (50µM 20 minuti prima dell'ischemia) ha indotto una riduzione significativa dell'area infartuata e dei livelli di LDH. Le analisi di Western Blot eseguite sugli estratti proteici delle porzioni apicali dei cuori hanno dimostrato che l'IR ha causato la formazione del complesso proteico NLRP3, ma in presenza del trattamento farmacologico la sua espressione ed attività sono state ridotte in maniera tempo-dipendente, come documentato dalle variazioni dei livelli delle proteine NLRP3, caspasi-1 e Gasdermin. Il saggio ELISA, inoltre, ha permesso di identificare una riduzione dell'espressione di IL-1β. Nelle analisi di WB effettuate per valutare la modulazione dei componenti della via RISK è stato evidenziato un aumento dell'espressione e dell'attività di phERK, phAKT e phGSK-3β nei cuori pretrattati con INF4E. E' stata anche valutata l'espressione dei markers della biogenesi mitocondriale e si è riscontrato un incremento dei livelli di MtTFA, del fattore nucleare NRF-1 e della proteina chinasi sMtCK a seguito del pretrattamento con INF4E. I dati raccolti in questa tesi dimostrano per la prima volta che INF4E ha un ruolo protettivo contro il danno IR del miocardio, attraverso una serie di processi che comprendono l'inibizione di NLRP3, l'attivazione della via protettiva RISK e il miglioramento delle funzioni mitocondriali. 1)S.Toldo et al. The Inflammasome in Myocardial Injury and Cardiac Remodeling. Antioxidants & Redox Signaling.2014;Vol00;000¿000 2)C.B.Fordyce et al. Novel therapeutics in myocardial infarction: targeting microvascular dysfunction and reperfusion injury. Trends in Pharmacological Sciences.2015;Vol36;605-616| File | Dimensione | Formato | |
|---|---|---|---|
|
753488_tesi_rubicondo_ombretta_farmacia.pdf
non disponibili
Tipologia:
Altro materiale allegato
Dimensione
2.62 MB
Formato
Adobe PDF
|
2.62 MB | Adobe PDF |
I documenti in UNITESI sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
https://hdl.handle.net/20.500.14240/37814