Sepsis is an intricate health condition that stems from a damaging response of the host organism to an infection. Initially, the immune system is overstimulated, exhibiting a hyperinflammatory state due to excessive cytokine release, known as “cytokine storm” reaction that may result in tissue damage, which in turn leads to multi-organ dysfunction (MOD) and septic shock. The persistent inflammatory state can lead to immune effectors depletion, causing immune suppression, which is commonly seen in later stages of sepsis thus leaving patients vulnerable to secondary infections. Recent studies have demonstrated the involvement of the inducible T-cell costimulator (ICOS) and its unique ligand ICOSL expressed on activated T cells and antigen-presenting cells (APCs), respectively, in cytokine production and lymphocyte apoptosis. However, the role of ICOS-ICOSL pathway in the septic context has been poorly investigated. Thus, the purpose of this thesis is to investigate the involvement of ICOS and ICOSL in hyperinflammation, with a focus on the FAK-p38-NLRP3 axis, and immunosuppression typical of sepsis. To achieve this goal, a soluble recombinant form of ICOS (ICOS-Fc) was used as a pharmacological investigation tool, since it can act as both antagonist of ICOS and agonist of ICOSL, paying attention to the potential therapeutic effect as well. Polymicrobial sepsis was induced in five-month-old male mice through a cecal ligation and puncture (CLP) procedure. One-hour post-surgery, either the CLP or Sham (control) mice were randomly assigned to receive a single intravenous dose of ICOS-Fc, F119SICOS-Fc, a mutated form that lacks the ability to bind to ICOSL, or vehicle. Samples of organs and plasma were obtained 24 hours after the surgery for examination. When compared to Sham, CLP mice developed increased NLRP3 inflammasome activation resulting in cleavage of pro-caspase-1, as well as increased phosphorylation and thus activation of FAK and p38 MAPK kinases. As expected, this caused an increase in plasma cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ and IL-10), myeloperoxidase (MPO) activity in liver and kidney, liver injury (AST and ALT) and kidney dysfunction (creatinine and urea) and a reduced body temperature. Administration of ICOS-Fc to CLP mice reduced all these abnormalities caused by sepsis, as well as the clinical severity score assigned, except for MPO activity in liver. No beneficial effects were seen in CLP-mice treated with F119SICOS-Fc. In conclusion, we confirmed that ICOS-ICOSL pathway is involved in the immune-mediated inflammatory response caused by sepsis, therefore representing an attractive therapeutic target to be considered in clinical settings.

La sepsi è una condizione patologica complessa che deriva da una risposta dannosa dell'organismo ospite a un'infezione. Inizialmente, il sistema immunitario viene sovrastimolato, manifestando uno stato iperinfiammatorio dovuto all'eccessivo rilascio di citochine, noto come "tempesta citochinica", che può provocare danni ai tessuti, i quali a loro volta portano alla disfunzione multiorgano (MOD) e allo shock settico. Lo stato infiammatorio persistente può portare ad una riduzione delle cellule immunitarie effettrici, causando soppressione immunitaria comunemente osservata nelle fasi successive della sepsi, lasciando i pazienti vulnerabili a infezioni secondarie. Studi recenti hanno dimostrato il coinvolgimento del costimolatore inducibile delle cellule T (ICOS) e del suo unico ligando ICOSL, espressi rispettivamente sulle cellule T attivate e sulle cellule presentanti l'antigene (APC), nella produzione di citochine e nell'apoptosi dei linfociti. Tuttavia, il ruolo della via ICOS-ICOSL nel contesto settico è stato poco studiato. Lo scopo di questa tesi è quindi quello di indagare il coinvolgimento di ICOS e ICOSL nell'iperinfiammazione, con particolare attenzione all'asse FAK-p38-NLRP3, e nell'immunosoppressione tipica della sepsi. Per raggiungere questo obiettivo, è stata utilizzata una forma ricombinante solubile di ICOS (ICOS-Fc) come strumento di indagine farmacologica, in quanto può agire sia come antagonista di ICOS che come agonista di ICOSL, prestando attenzione anche al potenziale effetto terapeutico. La sepsi polimicrobica è stata indotta in topi maschi di cinque mesi mediante la procedura cecal ligation and puncture (CLP). Un'ora dopo l'intervento, i topi CLP o Sham (controllo) hanno ricevuto a caso una singola dose endovena di ICOS-Fc, F119SICOS-Fc, una forma mutata che non ha la capacità di legarsi a ICOSL, o un veicolo. Campioni di organi e di plasma sono stati ottenuti 24 ore dopo l'intervento per essere esaminati. Rispetto allo Sham, i topi CLP hanno sviluppato una maggiore attivazione dell'inflammasoma NLRP3 con conseguente clivaggio della pro-caspasi-1, nonché una maggiore fosforilazione e quindi attivazione delle chinasi FAK e p38 MAPK. Come previsto, ciò ha causato un aumento delle citochine plasmatiche (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ e IL-10), dell'attività della mieloperossidasi (MPO) nel fegato e nel rene, lesioni epatiche (AST e ALT) e disfunzioni renali (creatinina e urea) e una riduzione della temperatura corporea. La somministrazione di ICOS-Fc nei topi CLP ha ridotto tutte queste anomalie causate dalla sepsi, così come il punteggio di gravità clinica assegnato, ad eccezione dell'attività MPO nel fegato. Non sono stati osservati effetti benefici nei topi CLP trattati con F119SICOS-Fc. In conclusione, abbiamo confermato che la via ICOS-ICOSL è coinvolta nella risposta infiammatoria immunomediata causata dalla sepsi, rappresentando quindi un interessante bersaglio terapeutico da considerare in ambito clinico.

Effetti di un innovativo approccio farmacologico immuno-mediato per contrastare la tempesta citochinica evocata dalla sepsi

CUTE, FLORIN ALEXANDRU
2021/2022

Abstract

La sepsi è una condizione patologica complessa che deriva da una risposta dannosa dell'organismo ospite a un'infezione. Inizialmente, il sistema immunitario viene sovrastimolato, manifestando uno stato iperinfiammatorio dovuto all'eccessivo rilascio di citochine, noto come "tempesta citochinica", che può provocare danni ai tessuti, i quali a loro volta portano alla disfunzione multiorgano (MOD) e allo shock settico. Lo stato infiammatorio persistente può portare ad una riduzione delle cellule immunitarie effettrici, causando soppressione immunitaria comunemente osservata nelle fasi successive della sepsi, lasciando i pazienti vulnerabili a infezioni secondarie. Studi recenti hanno dimostrato il coinvolgimento del costimolatore inducibile delle cellule T (ICOS) e del suo unico ligando ICOSL, espressi rispettivamente sulle cellule T attivate e sulle cellule presentanti l'antigene (APC), nella produzione di citochine e nell'apoptosi dei linfociti. Tuttavia, il ruolo della via ICOS-ICOSL nel contesto settico è stato poco studiato. Lo scopo di questa tesi è quindi quello di indagare il coinvolgimento di ICOS e ICOSL nell'iperinfiammazione, con particolare attenzione all'asse FAK-p38-NLRP3, e nell'immunosoppressione tipica della sepsi. Per raggiungere questo obiettivo, è stata utilizzata una forma ricombinante solubile di ICOS (ICOS-Fc) come strumento di indagine farmacologica, in quanto può agire sia come antagonista di ICOS che come agonista di ICOSL, prestando attenzione anche al potenziale effetto terapeutico. La sepsi polimicrobica è stata indotta in topi maschi di cinque mesi mediante la procedura cecal ligation and puncture (CLP). Un'ora dopo l'intervento, i topi CLP o Sham (controllo) hanno ricevuto a caso una singola dose endovena di ICOS-Fc, F119SICOS-Fc, una forma mutata che non ha la capacità di legarsi a ICOSL, o un veicolo. Campioni di organi e di plasma sono stati ottenuti 24 ore dopo l'intervento per essere esaminati. Rispetto allo Sham, i topi CLP hanno sviluppato una maggiore attivazione dell'inflammasoma NLRP3 con conseguente clivaggio della pro-caspasi-1, nonché una maggiore fosforilazione e quindi attivazione delle chinasi FAK e p38 MAPK. Come previsto, ciò ha causato un aumento delle citochine plasmatiche (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ e IL-10), dell'attività della mieloperossidasi (MPO) nel fegato e nel rene, lesioni epatiche (AST e ALT) e disfunzioni renali (creatinina e urea) e una riduzione della temperatura corporea. La somministrazione di ICOS-Fc nei topi CLP ha ridotto tutte queste anomalie causate dalla sepsi, così come il punteggio di gravità clinica assegnato, ad eccezione dell'attività MPO nel fegato. Non sono stati osservati effetti benefici nei topi CLP trattati con F119SICOS-Fc. In conclusione, abbiamo confermato che la via ICOS-ICOSL è coinvolta nella risposta infiammatoria immunomediata causata dalla sepsi, rappresentando quindi un interessante bersaglio terapeutico da considerare in ambito clinico.
ENG
Sepsis is an intricate health condition that stems from a damaging response of the host organism to an infection. Initially, the immune system is overstimulated, exhibiting a hyperinflammatory state due to excessive cytokine release, known as “cytokine storm” reaction that may result in tissue damage, which in turn leads to multi-organ dysfunction (MOD) and septic shock. The persistent inflammatory state can lead to immune effectors depletion, causing immune suppression, which is commonly seen in later stages of sepsis thus leaving patients vulnerable to secondary infections. Recent studies have demonstrated the involvement of the inducible T-cell costimulator (ICOS) and its unique ligand ICOSL expressed on activated T cells and antigen-presenting cells (APCs), respectively, in cytokine production and lymphocyte apoptosis. However, the role of ICOS-ICOSL pathway in the septic context has been poorly investigated. Thus, the purpose of this thesis is to investigate the involvement of ICOS and ICOSL in hyperinflammation, with a focus on the FAK-p38-NLRP3 axis, and immunosuppression typical of sepsis. To achieve this goal, a soluble recombinant form of ICOS (ICOS-Fc) was used as a pharmacological investigation tool, since it can act as both antagonist of ICOS and agonist of ICOSL, paying attention to the potential therapeutic effect as well. Polymicrobial sepsis was induced in five-month-old male mice through a cecal ligation and puncture (CLP) procedure. One-hour post-surgery, either the CLP or Sham (control) mice were randomly assigned to receive a single intravenous dose of ICOS-Fc, F119SICOS-Fc, a mutated form that lacks the ability to bind to ICOSL, or vehicle. Samples of organs and plasma were obtained 24 hours after the surgery for examination. When compared to Sham, CLP mice developed increased NLRP3 inflammasome activation resulting in cleavage of pro-caspase-1, as well as increased phosphorylation and thus activation of FAK and p38 MAPK kinases. As expected, this caused an increase in plasma cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ and IL-10), myeloperoxidase (MPO) activity in liver and kidney, liver injury (AST and ALT) and kidney dysfunction (creatinine and urea) and a reduced body temperature. Administration of ICOS-Fc to CLP mice reduced all these abnormalities caused by sepsis, as well as the clinical severity score assigned, except for MPO activity in liver. No beneficial effects were seen in CLP-mice treated with F119SICOS-Fc. In conclusion, we confirmed that ICOS-ICOSL pathway is involved in the immune-mediated inflammatory response caused by sepsis, therefore representing an attractive therapeutic target to be considered in clinical settings.
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