Effetto di coniugati cetuximab-5-fluorouracile sulla proliferazione di cellule di tumore del colonretto.

Colorectal cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed cancer in men and the second diagnosed in women and mainly affects population over 50 years1. To date, survival after the diagnosis of metastatic colorectal cancer has improved mostly due to therapies that work towards specific targeted (targeted therapy), in particular monoclonal antibodies anti¿EGFR such as cetuximab (CTX)2. CTX inhibits tumor growth, angiogenesis and induces apoptosis of tumor cells by binding to EGFR extracellular domain. Primary and secondary resistances due to mutations in the genes codifying for EGFR pathway proteins (RAS, BRAF, PI3K/PTEN) or amplification of other receptors belonging to the ErbB family is the main problem linked to the use of this antibody3. A possible strategy to overcome resistance is represented by the use of antibody-drug conjugates. This strategy also allows to take advantage of directionality conferred by the antibody and thus reduces side effects. The aim of this thesis was to evaluate the antiproliferative effect of conjugates between CTX and 5-fluorouracil (5-FU), drug commonly used in CRC, on an EGFR-overexpressing coloncancer cell line, DiFi. The series of tested conjugates (CTX-der) were synthesized by Prof. Barge, of the Organic Chemistry Laboratory of DSTF. The CTX¿der were synthesized by conjugating the antibody to 5-FU by a linker, with the formation of a strict product able to enter the cell and then release the drug. It was possible to change the degree of CTX substitution, modifying the time of reaction by modulating the number of 5-FU units for antibody. The antiproliferative effect of CTX-der was evaluated through the measurement of the ATP produced by cells using CellTiterGlo assay. The effect was also tested on DiFi made resistant to CTX (DiFi-R) through a treatment with the drug for a long time. Furthermore, it was evaluated the ability of CTX-der to modulate the activation of proteins downstream EGFR, such as AKT and MAPK, by western blot. The results have shown how the conjugates are able to inhibit cell proliferation in a dose-dependent way. The CTX-der antiproliferative effect in DiFi is similar to that obtained treating cells with CTX, underlining how the conjugation with 5-FU is not able to modify the antibody structure; DiFi-R are more sensitive to CTX-der than to CTX. In future, we'll try to increase 5-FU molecules conjugated to the antibody to increase the antiproliferative effect of the conjugates in comparison to that obtained with the drugs alone; the strategies to concentrate 5-FU could be the use of nanoparticles or nanodiamonds.

Il carcinoma colon rettale (CRC) è il terzo tumore più comunemente diagnosticato negli uomini, il secondo nelle donne e colpisce prevalentemente la popolazione al di sopra dei 50 anni1. Ad oggi, la sopravvivenza dopo la diagnosi di CRC metastatico è migliorata e a questo hanno contribuito maggiormente le terapie che agiscono verso target mirati (targeted therapy), in particolare anticorpi monoclonali anti-EGFR, come il cetuximab (CTX)2. Il CTX, legando il dominio extracellulare del recettore, ne impedisce l'attivazione e conseguentemente inibisce la crescita tumorale, l'angiogenesi e induce l'apoptosi delle cellule tumorali. Un ostacolo all'utilizzo del CTX è la resistenza, primaria o secondaria, dovuta a mutazioni a carico dei geni che codificano per le proteine del pathway di EGFR (RAS, BRAF, PI3K/PTEN) o amplificazione di altri recettori della famiglia di ErbB3. Una possibile strategia per superare la resistenza è rappresentata dall'utilizzo di coniugati anticorpo-farmaco, che permettono inoltre di sfruttare la direzionalità conferita dall'anticorpo e ridurre quindi la comparsa di eventi indesiderati. Scopo della tesi è stato valutare l'effetto antiproliferativo di coniugati tra il CTX e il 5-fluorouracile (5-FU), farmaci comunemente utilizzati nella terapia del carcinoma colorettale, in una linea cellulare di tumore del colon, le DiFi, che iperesprimono EGFR. La serie di coniugati (CTX-der) testati è stata sintetizzata dal Prof. Barge, del laboratorio di Chimica Organica del DSTF. I CTX-der sono stati sintetizzati coniugando l'anticorpo al 5-FU mediante un linker, con formazione di un prodotto stabile in grado di entrare all'interno della cellula e qui di liberare il farmaco. Variando il tempo di reazione è stato possibile modificare il grado di sostituzione del CTX, modulando il numero delle unità di 5-FU per anticorpo. L'effetto antiproliferativo dei CTX-der, valutato attraverso la misurazione dell'ATP prodotto dalle cellule attraverso il saggio CellTiterGlo, è stato testato anche su DiFi rese resistenti al CTX (DiFi-R) attraverso un trattamento per lungo tempo con il farmaco. Inoltre, è stato valutata, mediante western blot, la capacità dei CTX-der di modulare l'attivazione di proteine a valle dell'EGFR, come AKT e le MAPK. I risultati ottenuti hanno evidenziato come i coniugati siano in grado di inibire la proliferazione cellulare in modo dose-dipendente; nelle DiFi l'effetto antiproliferativo dei CTX-der è sovrapponibile a quello del CTX, evidenziando quindi come la coniugazione con il 5-FU non modifichi la struttura dell'anticorpo. Al contrario, nelle DiFi-R i coniugati inibiscono in misura maggiore la proliferazione cellulare. In futuro si dovrà aumentare il numero di molecole di 5-FU per molecola di anticorpo, nel tentativo di aumentare l'effetto dei coniugati rispetto ai singoli farmaci, per esempio attraverso l'utilizzo di nanoparticelle o nanodiamanti in cui concentrare il farmaco da coniugare al cetuximab.