Nanoemulsioni parenterali funzionalizzate con ghost cellulari: studi preliminari per la veicolazione di farmaci antitumorali

The experimental thesis concerned the formulation and characterization of parenteral nanoemulsions, such as Intralipid 10% (IL), as a vehicle for anticancer drugs. Such nanoemulsions should be used for the chemotherapy of high-grade gliomas, primary tumors of the central nervous system (CNS), characterized by a negative prognosis and a relapsing phenotype. The main innovation is the wrapping process of IL oil droplets with cellular ghosts. These membranes should be obtained by tumor cells from the patient's biopsy, in order to have an active targeting to the tumor, due to the adhesion proteins expressed on the ghosts surface. In our preclinical study, F98 rat glioma cells were chosen to obtain the ghosts, because they could potentially drive the coated formulations to the tumor stereotaxically implanted in the nucleus caudatus of syngeneic Fischer/F98 rat glioma models. On the other hand, ghosts obtained from more available erythrocytes (RBCs) were used as models to study the effect of the coating process, which was followed step by step through microscopic fluorescence and immunofluorescence techniques. Doxorubicin (DOX) was used as the model drug. It was loaded into IL as ion pairs, alternatively obtained with chlorambucil (CLB), an alkylating agent, or dioctyl sulfosuccinate (AOT), an anionic surfactant. DOX was loaded both in the non-functionalized IL and in IL coated with cellular ghost. The nanoemulsions obtained were characterized from a chemical-physical point of view, in terms of average size, surface charge, morphology, protein coating and drug loading and release. Preliminary in vitro cytotoxicity studies on F98 cells showed that DOX maintains its activity if loaded both into coated and non-functionalized formulations. Finally, preliminary pharmacokinetic and biodistribution studies on animal models (healthy rats) were performed, by exploiting the intrinsic fluorescence of DOX for HPLC analysis. The effect of drug loading in functionalized nanoemulsions was observed by considering both the permanence of the drug in the systemic circulation, compared to non-functionalized nanoemulsions, and the drug biostribution, compared to free DOX. Therefore, further in vivo studies will be planned by increasing the cohorts of animals, as well as by using the nanoemulsions coated with F98 ghost on the syngeneic Fischer/F98 rat glioma model.

La tesi sperimentale ha riguardato la formulazione e la caratterizzazione di nanoemulsioni parenterali, come l’Intralipid 10% (IL), come veicolo di farmaci antitumorali, finalizzati alla chemioterapia dei gliomi di alto grado, tumori primari del sistema nervoso centrale (SNC) con prognosi negativa e fenotipo recidivante. La principale innovazione è data dalla possibilità di rivestire le goccioline di IL con ghost cellulari, cioè membrane ricavate da cellule tumorali della biopsia del paziente, in modo tale da ottenere un direzionamento attivo al tumore, dovuto alle proteine di adesione presenti sulla superficie dei ghost. Nel nostro studio preclinico, sono state scelte le cellule di glioma F98 per ricavare i ghost, poiché, nel modello singenico di glioma di ratto Fischer/F98, potenzialmente potrebbero direzionare le formulazioni rivestite verso la sede del tumore impiantato stereotassicamente nel nucleo caudato dell’animale. Inoltre, per studiare l’effetto del rivestimento sul comportamento chimico-fisico delle formulazioni e sul loro destino biologico, in via preliminare sono stati utilizzati ghost ricavati da eritrociti (RBC), impiegati come modello di studio, perché in questo caso è possibile testarle su ratti Wistar sani, più versatili e disponibili, e meno invasivi, come modelli, rispetto ai Fischer/F98. Il rivestimento delle formulazioni è stato seguito step by step attraverso tecniche microscopiche di fluorescenza ed immunofluorescenza. La doxorubicina (DOX) è stata utilizzata come farmaco modello. Essa è stata caricata in IL attraverso la formazione di coppie ioniche: una è stata realizzata con il clorambucile (CLB), un agente alchilante e la seconda con il dioctil solfosuccinato (AOT), un tensioattivo anionico. E’ quindi stato intrapreso uno studio volto al caricamento della DOX sia nell’IL non funzionalizzato, che in quello rivestito con ghost cellulari. Le nanoemulsioni ottenute sono state caratterizzate dal punto di vista chimico-fisico, in termini di dimensione media, carica superficiale, morfologia, rivestimento proteico e caricamento e rilascio del farmaco. Gli studi preliminari di citotossicità in vitro su cellule F98 hanno dimostrato che la DOX mantiene la sua attività anche quando caricata nelle formulazioni funzionalizzate e non. Infine, sono stati condotti studi preliminari di farmacocinetica e biodistribuzione con formulazioni selezionate su modelli animali (ratti sani), sfruttando la fluorescenza intrinseca della DOX per l’analisi HPLC. Si è osservato il ruolo del caricamento nelle nanoemulsioni funzionalizzate sia nell’implementare la permanenza in circolo del farmaco rispetto alle nanoemulsioni non funzionalizzate, sia nel determinare la biostribuzione del farmaco, rispetto alla DOX libera. In prospettiva si pensa di proseguire gli studi in vivo, sia implementando le coorti di animali, sia utilizzando le nanoemulsioni rivestite con ghost F98 sul modello singenico di glioma di ratto Fischer/F98.