Messa a punto di saggi per la valutazione dell'attivazione del recettore P2X7

P2X7 receptor (P2X7R) is a purinergic receptor that plays a pivotal role in regulating the innate immune system and inflammatory signaling. Activation of P2X7 receptor promotes Ca2+ and Na+ influx and K+ efflux, whereas repeated or prolonged activation induces the formation of a non-selective dye permeable pore. Cationic dyes such as YO-PRO-1 enter the cell and bind to DNA, which is detected by fluorescence measurement. The aim of this project was to establish assays that allow characterization of different substances for P2X7R activation. First, THP-1 macrophages were stimulated with the P2X7 receptor agonist 2,3-O-(4-Benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP) to induce pore formation that leads to YO-PRO-1 uptake. Initially, the fluorescence emission was measured using a flow cytometer and a microplate-reader (FLEX station). Since we could not detect an increase in fluorescence intensity of BzATP-stimulated compared to non-stimulated THP-1 macrophages, we decided to use HEK293 cells transfected with the human P2X7 receptor. Transfection was verified with western blot analysis. The transfected HEK293 cells stimulated with BzATP and Adenosinetriphosphate (ATP) showed an increase in fluorescence intensity measured by flow cytometry, whereas Adenosinetetraphosphate (Ap4) did not. Moreover, we wanted to confirm our findings of P2X7 receptor activation by measuring Ca2+-influx using the Ca2+ sensitive dye Fluo-4. Fluorescence was measured with the FLEX station. The results provided evidence about the ability of BzATP to activate the receptor at higher concentration, whereas ATP and Ap4 induced Ca2+ influx could not be detected. In summary, two methods for P2X7 receptor activation could be established. Different compounds were tested for P2X7 receptor activity with YO-PRO assay performed by flow cytometry and Calcium assay, whereas flow cytometry seems to be the more accurate method.

Il P2X7 è un recettore purinergico che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del sistema immunitario innato e dei segnali coinvolti nell'infiammazione. L'attivazione del recettore P2X7 promuove l'afflusso di Ca2+ e Na+ e l'efflusso di K+, mentre l'attivazione ripetuta o prolungata induce la formazione di un poro permeabile a coloranti non selettivi. I coloranti cationici, come YO-PRO-1, entrano nella cellula, si legano al DNA e vengono rilevati mediante la misurazione della fluorescenza. Lo scopo di questo progetto è stato quello di stabilire saggi che permettano di caratterizzare diverse sostanze per l'attivazione del recettore P2X7. In primo luogo, i macrofagi THP-1 sono stati stimolati con l'agonista del recettore P2X7, 2,3–O-(4-Benzoilbenzoil)-ATP (BzATP), per indurre la formazione del poro che porta all'assorbimento di YO-PRO-1. Inizialmente, l'emissione di fluorescenza è stata misurata utilizzando un citofluorimetro e un lettore di micropiastre (FLEX station). Poiché non siamo riusciti a rilevare un aumento dell'intensità di fluorescenza derivata dai macrofagi THP-1, stimolati con BzATP rispetto a quelli non stimolati, abbiamo deciso di utilizzare cellule HEK293, trasfettate con il recettore P2X7 umano. Il processo di trasfezione è stato verificato mediante l'analisi effettuata con il western blot. Le cellule HEK293 trasfettate, stimolate con BzATP e Adenosin-trifosfato (ATP), hanno mostrato un aumento dell'intensità della fluorescenza misurata con la citometria a flusso, mentre con l'Adenosinetrafosfato (Ap4) non è stato possibile ottenere lo stesso risultato. Inoltre, abbiamo voluto confermare i risultati ottenuti studiando l’attivazione del recettore P2X7, misurando l'afflusso di Ca2+, utilizzando il colorante Fluo-4, sensibile al Ca2+. La fluorescenza è stata misurata con lo strumento FLEX station. I risultati hanno evidenziato la capacità di BzATP di attivare il recettore alla concentrazione più elevata, mentre non è stato possibile rilevare l'afflusso di Ca2+ indotto da ATP e Ap4. In sintesi, è stato possibile stabilire due metodi per la valutazione dell'attivazione del recettore P2X7. Diversi composti sono stati testati per determinare l'attività del recettore P2X7: ciò è stato effettuato con il saggio YO-PRO, eseguito con il citofluorimetro, e con il saggio del calcio. In conclusione, la citometria a flusso sembra essere il metodo più accurato.