Difetti del gating del canale del calcio di tipo L in cellule cromaffini surrenali indotti dalla mutazione ¿gain of function¿ A749G di CACNA1D associata al disturbo dello spettro autistico

L-type dependent calcium channels (Cav1.1 to Cav1.4) are widely expressed in various cell types. In particular, the Cav1.3 channel isoform is widely expressed in endocrine cells, sinoatrial node cells, cochlear inner hair cells and brain neurons. They are essential for the activity of cardiac pacemaking, auditory perception, hormone secretion, cell firing and neuronal plasticity. Cav1.3 play a fundamental role as regulators of many intracellular processes including gene expression and membrane proteins regulation (receptors and ion channels) (Catteral et al., 2011). The aim of this thesis work was to analyze the effects of Cav1.3-type calcium channel dysfunctions induced by the A749G mutation in heterozygous mice on the voltage-dependence and time course of L-type Ca2+ currents that regulate adrenal chromaffin cells excitability. The A749G point mutation mimics a mutation recently uncovered in a young patient affected by autism (Pinggera et al., 2015). It is located in the α1 pore-forming subunit of Cav1.3 (CACNA1D) and is due to the substitution of an alanine with a glycine in position 749, at the end of the IIS6 transmembrane segment of the channel. A749G is considered a high-risk conferring mutation in a cohort of patients with autism and intellectual disability (O'Roak et al., Nature, 2012). Thanks to the experiments previously conducted on cDNA expression systems (tsA-201 cells; Pinggera et al., 2015), the Ca2+ currents carried by the mutated L-type channel are shown to activate at more negative potentials and inactivate faster and more completely than the wild-type (WT) non mutated channel. We investigated whether these variations are also evident in the native L-type channels of primary cell cultures of KI CavAG/WT mouse chromaffin cells bearing the A749G mutation. We also tested how the mutation induce persistent Ca2+ currents at rest capable of altering cell excitability. The heterologous CavAG/WT mouse was generated in the laboratory of prof. Striessnig (Innsbruck University). For the experiments we used the ¿patch-clamp¿ technique in the patch-perforated configuration to preserve the cell interior. Experiments were in voltage-clamp conditions, where the membrane potential is fixed spatially and temporally to measure the current and, thus, the membrane "conductance" associated with the L-type channels (Cav1.2 and Cav1.3) expressed in chromaffin cells. Specific blockers for the other non-L calcium channel isoforms were used to pharmacologically isolate the L-type currents and study them in isolation. In a first series of experiments using protocols of sequential depolarizations with square pulses of increasing voltage, we recorded a shift of the current-voltage characteristics of about 6 mV toward more negative values. The inactivation of the mutated L-type current during step depolarization of 1-5 s at + 10 mV is faster and more complete, while the steady state inactivity curve is also shifted towards more negative potentials. The Ca2+-dependent inactivation (CDI) of mutated channels conversely showed a few mV to negative shift and a reduction of mean current values. CDI is therefore faster and more complete. The "window current", obtained from the product of the conductance curve multiplied by the inactivation curve in the mutated cells times the driven force (V-ECa), is slightly smaller than in WT cells, but sharply shifted to more negative potentials (-40, -50 mV). This suggests a considerable accumulation of Ca2+ in the m

I canali del calcio voltaggio dipendenti di tipo L (LTCCs) sono ampiamente espressi in vari organi e tipi cellulari. In particolare, i canali dell'isoforma Cav1.3 sono espressi nelle cellule endocrine, le cellule pacemaker del cuore, le cellule cigliate della coclea ed i neuroni centrali e sono pertanto essenziali per l'attività di pacemaker cardiaco, la percezione uditiva, la secrezione ormonale. I Cav1.3 regolano, inoltre, firing e plasticità neuronale. Regolando il Ca2+ citoplasmatico i Ca1.3 svolgono anche un ruolo fondamentale nella regolazione di numerosi processi intracellulari tra cui l'espressione genica e la sintesi di proteine e recettori (Catteral, 2011). Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di effettuare una serie di esperimenti volti ad analizzare gli effetti delle disfunzioni dei canali del calcio di tipo Cav1.3 indotte dalla mutazione A749G in topi eterozigoti che mimano la stessa mutazione presente in pazienti giovani affetti da autismo. La mutazione è puntiforme a livello della subunità principale α1 di Cav1.3 (CACNA1D) ed è dovuta alla sostituzione di una alanina con una glicina in posizione 749, ovvero sul sesto segmento transmembrana del secondo dominio omologo, II6S. La mutazione A749G è considerata ad alto rischio in una coorte di pazienti con autismo e disabilità intellettuale (O'Roak et al., Nature, 2012). Grazie agli esperimenti precedentemente condotti su sistemi eterologhi (Pinggera et al., 2015), sappiamo che le correnti di calcio trasportate dal canale mutato, espresso nelle cellule tsA-201, sono attivate a potenziali più negativi e si inattivano più velocemente dei canali Cav1.3 non mutati (wild-type, WT). Nel nostro laboratorio, usando le cellule cromaffini della midollare surrenali di topi giovani, abbiamo studiato se queste variazioni sono anche evidenti in colture cellulari primarie di topi eterologhi CavAG/WT generati nel laboratorio del prof. Striessnig e se queste mutazioni inducono correnti persistenti a riposo capaci di alterare l'eccitabilità cellulare. Gli esperimenti sono stati effettuati con la tecnica di elettrofisiologia classica del patch-clamp, e in particolare mi sono occupata degli esperimenti in voltage-clamp, dove il potenziale di membrana è fissato spazialmente e temporalmente per misurare la corrente e quindi la ¿conduttanza¿ di membrana associata ai canali di tipo L (Cav1.2 e Cav1.3) espressi in cellule cromaffini CavAG/WT mutate e WT. Sono stati usati dei bloccanti specifici per le altre isoforme di canali del calcio non-L in modo da isolare farmacologicamente le correnti di tipo L e poterle studiare in isolamento. Come prima cosa abbiamo registrato uno spostamento della curva I/V (intensità di corrente in funzione del potenziale, ottenuta con un protocollo di impulsi a forma quadrata di potenziale variabile) di ~ 6 mV verso valori più negativi. L'inattivazione della corrente di tipo L durante una lunga depolarizzazione a +10 mV (della durata di 1-5 s) è più veloce e completa e la curva di inattivazione allo stato stazionario è spostata anch'essa verso valori più negativi. L'inattivazione Ca2+-dipendente (CDI) ha invece mostrato non solo uno spostamento di pochi mV verso potenziali più negativi ma anche un abbassamento dei valori medi a potenziali positivi. La "window current", ottenuta dal prodotto della curva di conduttanza moltiplicata per la curva di inattivazione nelle cellule mutate è leggermente più piccola delle cellule WT, ma spostata a potenziali più negativ