Studio dei meccanismi molecolari della cardiotossicità indotta da Doxorubicina: ruolo delle alterazioni del metabolismo cardiaco

Anthracyclines, such as doxorubicin (DOX) are drugs used against solid and haematological malignancies, although their use is limited by important short- and long-term cardiotoxic effects. The aim of this study was to shed light on some of the mechanisms of DOX-induced cardiotoxicity. Previous work by the research team has shown that anthracyclines accumulate mainly in the mitochondria and nucleus, damaging cardiomyocytes. It has also been demonstrated that DOX-induced mitochondrial damage activates the PI3Kγ/Akt/mTOR pathway, inducing a blockage in mitochondrial autophagy, resulting in an accumulation of non-functioning organelles that produce reactive oxygen species with cytotoxic activity. Therefore, in the first part of this work, we analyzed the possible metabolic repercussions of the mitophagy blockage induced by DOX, evaluating the impact of treatment in in vivo and in vitro models and monitoring the functionality of the mitochondrial respiration and glycolytic metabolism. It was demonstrated that DOX impairs mitochondrial metabolism and determines an increase in glucose utilization, both in early and late treatment phase. This metabolic remodulation is absent if PI3Kγ activity is blocked. From a mechanistic point of view, it has been observed that the increase in glucose uptake and in the activity of glycolytic enzymes induced by DOX is due to a greater translocation of the Glut-4 receptor in the membrane mediated by PI3Kγ. This augmented glycolytic metabolism would initially be compensatory but in the long term it could be insufficient to support cardiac metabolic demands and, thus, contribute to the heart failure condition, typical of DIC. It is known that metabolic alterations can contribute to the onset of senescence, a phenotypic condition of cellular aging, characterized by the secretion of pro-inflammatory elements (SASP), with an emerging role in the pathogenesis of cardiovascular diseases. Therefore, in the second part of this work, we evaluated the involvement of PI3Kγ in the acquisition of this phenotype following treatment with DOX. It has been demonstrated that DOX-treated cardiac fibroblasts release SASP elements, including GDF-15, which can activate the PI3Kγ/Akt pathway, promoting senescence-associated p21 transcription. At the molecular level, it has been hypothesized that DOX can induce senescence in heart cells as a consequence of nuclear damage and it has been observed that DOX treatment can induce nuclear membrane disruption and activation of the cGAS-STING pathway, with phosphorylation of Nf-Kb and IRF3 and the production of SASP cytokines. This study therefore allows to shed light on some of the mechanisms of doxorubicin-induced cardiotoxicity, demonstrating the presence of mitochondrial damage and the role of PI3Kγ in determining metabolic alterations and progression towards cardiac senescence, and of nuclear damage, which it can contribute to the manifestation of the senescent phenotype. From a translational point of view, these findings promote the possibility to early recognize the development of anthracycline-induced cardiotoxicity and intervening therapeutically against senescence.

Le antracicline, come la doxorubicina (DOX) sono farmaci impiegati per il trattamento di neoplasie solide ed ematologiche, nonostante il loro utilizzo sia limitato da importanti effetti cardiotossici a breve e lungo termine. Lo scopo di questo studio è stato di far luce su alcuni di meccanismi di cardio-tossicità indotta da DOX. Lavori precedenti del gruppo di ricerca hanno dimostrato che nelle cellule cardiache le antracicline si accumulano prevalentemente a livello dei mitocondri e del nucleo, danneggiandoli. È stato inoltre dimostrato come il danno mitocondriale indotto da DOX attivi il pathway di PI3Kγ/Akt/mTOR, inducendo un blocco di autofagia mitocondriale, determinando un accumulo di organelli non funzionanti che producono specie reattive dell’ossigeno con attività citotossica. Nella prima parte di questo lavoro di tesi ci si è quindi interrogati su quali possano essere le ripercussioni metaboliche del blocco della mitofagia indotto da DOX, valutando l’impatto del trattamento con il chemioterapico in modelli in vivo e in vitro e monitorando la funzionalità della respirazione mitocondriale e del metabolismo glicolitico. È emerso che la DOX comporta la compromissione del metabolismo mitocondriale ed un aumento compensatorio dell’utilizzo del glucosio, sia in fase precoce che, ancora maggiormente, in fase tardiva. Questa rimodulazione metabolica è invece assente qualora venga bloccata l’attività di PI3Kγ. Dal punto di vista meccanicistico, è stato osservato che l’aumento dell’ingresso del glucosio nel cardiomiocita e l’incremento dell’attività degli enzimi glicolitici indotto da DOX e’ dovuto ad una maggiore traslocazione del recettore Glut-4 in membrana mediato da PI3Kγ. Tale aumento del metabolismo glicolitico sarebbe compensatorio ma a lungo termine potrebbe risultare insufficiente a sostenere le richieste metaboliche cardiache e contribuire così alla condizione di scompenso tipica della DIC. È noto che le alterazioni metaboliche possono contribuire al manifestarsi della senescenza, una condizione fenotipica di invecchiamento cellulare, caratterizzata tra l’altro da secrezione di elementi pro-infiammatori (SASP), con un ruolo emergente nella patogenesi delle malattie cardiovascolari. Pertanto, nella seconda parte di questo lavoro di tesi, si è voluto valutare il coinvolgimento di PI3Kγ nell’acquisizione di questo fenotipo in seguito a trattamento con DOX. È stato osservato che i fibroblasti cardiaci trattati con DOX rilasciano elementi propri del SASP, tra cui GDF-15, che può attivare il pathway di PI3Kγ/Akt, promuovendo la trascrizione di p21, associato alla senescenza. E’ stato ipotizzato che la DOX induca senescenza nelle cellule cardiache come conseguenza del danno a livello nucleare. È stato osservato che il trattamento con DOX può indurre rottura della membrana nucleare e attivazione del cGAS-STING pathway, con fosforilazione di Nf-Kb e IRF3 e la produzione di citochine del SASP. Questo studio permette quindi di far luce su alcuni di meccanismi di cardio-tossicità indotta da doxorubicina, dimostrando la presenza di un danno mitocondriale e il ruolo di PI3Kγ nel determinare alterazioni metaboliche e la progressione verso la senescenza cardiaca, e di un danno nucleare, che può contribuire al manifestarsi del fenotipo senescente. Vengono quindi poste le basi per la possibilità di riconoscere precocemente lo sviluppo di cardiotossicità da antracicline e intervenire dal punto di vista terapeutico nei confronti della senescenza.