Efficacia in vitro dei NORS come terapia alternativa per le endometriti nella bovina

Introduction: Postpartum diseases in cattle have a significant impact on productivity, fertility, survival, and welfare of dairy cows. Particularly, metritis and endometritis are the most common pathologies. The reduced efficacy of antibiotics in treating infections and the emergence of new resistance mechanisms globally compromise the effectiveness of such treatments, hence the need to research new therapeutic strategies. Among these, in the bovine field, there are aqueous preparations releasing nitric oxide (NORS), which have already been successfully used for the treatment of bacterial mastitis and respiratory diseases and could also be employed in the treatment of endometritis. Objectives: The aim of this study is to evaluate economically sustainable alternatives to antibiotics for farmers and to enable a more targeted and conscious use of the available therapeutic treatments by veterinarians. These data will provide an initial experimental approach for the subsequent field evaluation of NORS as a therapeutic agent for the antibiotic-free treatment of clinical and subclinical endometritis (EMC/EMSC) in cattle, contributing to the rationalization of antibiotic use in veterinary medicine and the maintenance of the effectiveness of Critically Important Antimicrobials (CIA) in human medicine. Materials and Methods: In the first phase, intrauterine samples were collected using cytobrush methodology to define the presence of major bacterial agents in endometritis, which allowed for the preparation of a bacterial collection comprising various bacteria of interest (E. coli, Salmonella sp., Mycoplasma spp., Trueperella pyogenes, Clostridium perfringens, Histophilus somni, Pasteurella multocida) to be used in the subsequent phase. For each strain of interest, multiple suspensions were created to be tested with NORS concentrations of 75 mM, 45 mM, 22.5 mM, 9 mM, 3 mM, 1 mM. The test regarding the action of NORS solutions on biofilm was conducted on two categories of bacterial strains cultured on plates (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922) to which activated NORS solutions were added. Continuous and primary cell lines (IPEC-J2 and FLECA) were tested for both the cytopathic effect of NORS and their immunomodulatory properties in terms of baseline gene expression of important molecules involved in innate immune response. Immunophenotypic characterization was performed using immunofluorescence experiments to observe the cytopathic effect. Results and Considerations: The bacterial agents deemed most significant as responsible for bovine endometritis (T. pyogenes, E. coli) were isolated, and the efficacy of NORS in vitro in inactivating various bacterial populations of interest in uterine pathology and their ability to form biofilm were verified. Furthermore, the safety of nitric oxide-releasing solutions on animal cells was evaluated in vitro to observe possible in vivo tolerance by assessing gene expression variations. Through the obtained data, it was possible to define the concentrations of NORS to be experimented with in vivo, corresponding to concentrations of 2 or 3 mM.

Introduzione: Le malattie del periodo post partum nel bovino hanno un impatto significativo sulla produttività, fertilità, sopravvivenza e benessere delle vacche da latte. In particolare, la metrite e l'endometrite sono le patologie più comuni. La ridotta efficacia degli antibiotici nel trattamento delle infezioni e l'emergere di nuovi meccanismi di resistenza a livello globale compromettono l'efficacia di tali trattamenti, per cui si ha la necessità di ricercare nuove strategie terapeutiche. Tra queste in ambito bovino si hanno le preparazioni acquose rilascianti ossido nitrico (NORS), che sono già state utilizzate con successo per il trattamento delle mastiti batteriche e nelle patologie respiratorie e potrebbero essere impiegate anche nella cura delle endometriti. Obiettivi: L’obiettivo di questo studio è quello di valutare metodi alternativi agli antibiotici, economicamente sostenibili per gli allevatori e che permettano di giungere ad un utilizzo più mirato e cosciente dei trattamenti terapeutici a disposizione del medico veterinario. Questi dati forniranno un primo approccio sperimentale per la successiva valutazione su campo dei NORS come agente terapeutico per il trattamento antibiotic-free delle endometriti cliniche e subcliniche (EMC/EMSC) nella bovina, contribuendo alla razionalizzazione dell’uso degli antibiotici in medicina veterinaria e al mantenimento dell’efficacia dei Critically Important Antimicrobials (CIA) in ambito umano. Materiali e metodi: Nella prima fase si è proceduto alla raccolta di campioni intrauterini mediante metodica cytobrush per definire la presenza dei principali agenti batterici in corso di endometrite che ha permesso di allestire una ceppoteca comprendente vari batteri di interesse (E. coli, Salmonella sp., Mycoplasma spp., Trueperella pyogenes, Clostridium perfringens, Histophylus somni, Pasteurella multocida) da utilizzarsi nella fase seguente. Per ogni ceppo di interesse sono state create più sospensioni da testare con concentrazioni di NORS pari a 75 mM, 45 mM, 22,5 mM, 9 mM, 3 mM, 1 mM. La prova relativa all’azione delle soluzioni NORS sul biofilm è stata condotta su due categorie di ceppi batterici coltivate su piastre (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922) a cui sono state aggiunta soluzioni NORS attivate. Su linee cellulari continue e primarie (IPEC-J2 e FLECA) sono stati testati sia l’effetto citopatico dei NORS sia le loro proprietà immuno-modulanti in termini di espressione genica basale di importanti molecole coinvolte nella risposta immunitaria innata. È stata eseguita la caratterizzazione immunofenotipica, effettuata con esperimenti di immunofluorescenza, per osservare l’effetto citopatico. Risultati e Considerazioni: Sono stati isolati gli agenti batterici ritenuti maggiormente significativi in qualità di responsabili di endometrite bovina (T. pyogenes, E. coli) ed è stata verificata l’efficacia dei NORS in vitro nell’inattivare varie popolazioni batteriche di interesse nella patologia uterina e la loro capacità di formare biofilm. Inoltre è stata valutata in vitro la sicurezza delle soluzioni rilascianti ossido nitrico sulle cellule animali per osservare la possibile tolleranza in vivo, valutando le variazioni dell’espressione genica. Tramite i dati ottenuti è stato quindi possibile definire le concentrazioni di NORS da sperimentare in vivo, che corrispondono a concentrazioni di 2 o 3 mM.