BIOFILM E LISTERIA MONOCYTOGENES: STUDIO DI ASSOCIAZIONE GENOMICA

Listeria monocytogenes is an opportunistic intracellular Gram-positive bacterium, an etiological agent of listeriosis, a serious disease with a high mortality rate, which occurs after ingestion of contaminated food, predominantly ready-to-eat (RTE). Listeria monocytogenes can grow in both planktonic and sessile form, organizing in biofilm, which gives the micro-organism the possibility to survive and develop in different adverse environmental conditions, ensuring its persistence in food processing environments. Listeria monocytogenes in biofilm form is a source of chronic contamination of food during processing in the food industry. It is important to note that the production of biofilm is a phenotypic character influenced by the presence/absence of genetic determinants as well as by various environmental factors such as temperature, surface type, presence of conditioning film etc. and by lineage and/or serotype of belonging. Through the study of genomic association with Whole-genome-sequencing (WGS) a potential correlation between biofilm phenotype and presence/absence and/or truncation of genetic determinants that govern its formation could be assessed. The first part of the work covered the evaluation of the biofilm phenotype and the categorisation into strong, moderate or weak producers of listeria momocytogenes isolated from meat, milk/derivatives and related production environments. In the second part of the work a genomic association analysis was carried out with respect to genes that, according to the literature, are involved in the biofilm formation process: lmo2026 (inlL), SSI-1, actA and inlA. In total, n.57 entirely sequenced strains of listeria monocytogenes were analysed, belonging to the strain library of the Dipartimento di Scienze Veterinarie di Torino and of the Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Torino. Stepanovic et al., 2007 protocol was used for the phenotype biofilm and the categorisation of strains. The research and identification of these genes was carried out through BLAST, comparing each gene to its gene sequence assembly. Finally, the research of Premature Stop Codons (PMSCs) on inlA and actA, was carried out manually by comparing the gene sequences of the strains with the database of the Pasteur insitut. Within the isolates, 58%, 38.5% and 3.5% were classified as weak, moderate or strong producers, respectively. Two isolates from the meat sector were classified as strong producers. The percentage of meat isolates (16%), classified as moderate/strong producers, was higher than the percentage of isolates from milk and dairy products (7%); the latter have shown significantly lower production of biofilm (p < 0,05). Increased biofilm production was observed in CC9 and CC31 strains. The presence of the five cluster genes lmo0444-lmo0448 (Stress Survival Islet 1) and truncated inlA was significantly associated with increased biofilm production. WGS analysis related to the biofilm phenotype could help predict the behavior of the micro-organism and thus provide valuable information for an adequate quantitative assessment of the microbiological risk represented by Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes è un batterio opportunistico intracellulare Gram-positivo ubiquitario, agente eziologico della listeriosi, patologia grave con alto tasso di mortalità, che si instaura in seguito ad ingestione di alimenti contaminati, prevalentemente ready-to-eat (RTE). Listeria monocytogenes può crescere sia in forma planctonica che sotto forma sessile, organizzandosi in biofilm, il quale conferisce al microrganismo la possibilità di sopravvivere e svilupparsi in diverse condizioni ambientali avverse, garantendone la persistenza negli ambienti di lavorazione degli alimenti. Listeria monocytogenes in forma biofilm rappresenta una sorgente di contaminazione cronica degli alimenti in fase di lavorazione nell'industria alimentare. È importante sottolineare che la produzione di biofilm è un carattere fenotipico influenzato da presenza/assenza di determinanti genici oltre che da diversi fattori ambientali quali temperatura, tipo di superficie, presenza di film condizionante ecc. nonché da lineage e/o sierotipo di appartenenza. Attraverso lo studio di associazione genomica mediante Whole-genome-sequencing (WGS) si potrebbe valutare una potenziale correlazione tra fenotipo biofilm e presenza/assenza e/o troncatura di determinanti genetici che presiedono alla sua formazione. La prima parte del lavoro ha riguardato la valutazione del fenotipo biofilm e la categorizzazione in forti, moderati o deboli produttori di ceppi di Listeria momocytogenes isolati da carne, latte/derivati e relativi ambienti di produzione. Nella seconda parte del lavoro è stata effettuata una analisi di associazione genomica rispetto a geni che, secondo quanto riportato dalla letteratura, sono coinvolti nel processo di formazione di biofilm: lmo2026 (inlL), SSI-1, actA e inlA. In totale sono stati analizzati n.57 ceppi, interamente sequenziati, di Listeria monocytogenes ed appartenenti alla ceppoteca del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell'Università degli Studi di Torino e dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Torino. Per il fenotipo biofilm e la categorizzazione dei ceppi è stato impiegato il protocollo di Stepanovi&#263; et al., 2007. La ricerca ed identificazione dei geni suddetti è stata eseguita attraverso BLAST, comparando ciascun gene al proprio assemblaggio di sequenza genica. Infine, la ricerca dei Codoni Prematuri di Stop (PMSCs) in merito ad inlA e actA, è stata effettuata manualmente confrontando le sequenze geniche dei ceppi con il database dell'Insitut Pasteur. Nell'ambito degli isolati, 58%, 38.5% e 3.5% sono stati classificati come deboli, moderati o forti produttori, rispettivamente. Due isolati da settore carni sono stati classificati come forti produttori. La percentuale di isolati dalle carni (16%), classificati come moderati/forti produttori, è stata più alta della percentuale di isolati da latte e derivati (7%); questi ultimi hanno evidenziato una produzione significativamente più bassa di biofilm (p<0,05). Una maggiore produzione di biofilm è stata osservata in ceppi appartenenti a CC9 e CC31. La presenza dei cinque geni cluster lmo0444-lmo0448 (Stress Survival Islet 1) e inlA troncata è stata significativamente associata con una aumentata produzione di biofilm. Le analisi WGS correlate al fenotipo biofilm potrebbero aiutare a predire il comportamento del microrganismo e fornire così informazioni preziose per una adeguata valutazione quantitativa del rischio microbiologico rappresentato da Listeria monocytogenes.