Alterazione del monostrato intestinale ad opera degli ossisteroli di origine alimentare: effetto protettivo di prodotti di recupero del cacao.

Oxysterols, the main oxidation products of cholesterol, can be synthesized in human cells and tissues by enzymatic or non-enzymatic reactions, or be introduced through the diet. During the processing and subsequent long-term storage of foods with a high cholesterol content, in fact, self-oxidation processes are activated, borne by the cholesterol molecule, capable of giving rise to oxysterols. These 27-carbon-atom cholesterol oxidation products have been extensively studied for their involvement in the pathogenesis of human degenerative diseases characterized by chronic inflammation, such as atherosclerosis, Alzheimer's disease, or chronic inflammatory bowel disease (IBD). Food-derived oxysterols have been widely shown to interfere with the homeostats of the intestinal epithelium, inducing mucosal inflammation and contributing to alteration of the structure and function of the intestinal barrier itself. In this study, CaCo-2 colon adenocarcinoma cells differentiated toward an enterocyte-like phenotype were used. Cells were treated with a mixture of oxysterols representative of a hypercholesterol diet (7 ketocholesterol, 5α, 6α- e 5β, 6β-epoxycholesterol, 7α- e 7β-hydroxycholesterol) at a final concentration of 60 µM. The potential ability of food-derived oxysterols to induce intestinal barrier instability has been assessed in terms of activation of matrix metalloproteinases (MMP)-2 and -9 (zymography), enzymes that correlate with changes in epithelium-cellular matrix interaction and tight junction modifications. Increased apoptosis may also play an important role in intestinal barrier damage. For this reason, the levels of the pro-apoptotic protein Bax and the anti-apoptotic protein Bcl-xL were analyzed by Western blotting after treatment with oxysterols. Treatment of differentiated cells with the mixture is responsible for an increased activity of MMP-2 and MMP-9. It also correlates with an increase in Bax protein levels and a corresponding decrease in Bcl-xL protein levels. In the case of both MMPs and apoptotic proteins, recovery of normal functional levels was observed following pretreatment with a specific chemical inhibitor of MMPs. A modulation of these same signals, responsible for a marked destabilization of the intestinal barrier, emerged following pretreatment of differentiated CaCo-2 with digested extracts of cocoa bean shell (CBS). A reduction in the levels of MMPs activation and a re-establishment of normal apoptotic levels was also observed in association with the treatment of cells with CBS-enriched chocolate ice cream extracts. In the second part of this work, in fact, the attention was focused on the possibility of exploiting the beneficial properties of what has always been considered a waste in the cocoa industry. The high concentration of biologically active molecules, such as polyphenols, with antioxidant and anti-inflammatory capacities could be responsible for the negative regulation of MMPs activation and apoptosis induced by the mixture of oxysterols. The positive biological impact of these industrial waste compounds could represent a valid approach in the development of strategies for their valorization as components of functional foods, such as ice cream, as well as a great opportunity to reduce their environmental impact by exploiting the possibility of their recycling.

Gli ossisteroli, i principali prodotti di ossidazione del colesterolo, possono essere sintetizzati nelle cellule e nei tessuti umani mediante reazioni enzimatiche o non enzimatiche, o essere introdotti attraverso la dieta. Durante la lavorazione e la successiva conservazione a lungo termine dei cibi ad alto contenuto di colesterolo, infatti, si attivano processi di auto-ossidazione, a carico della molecola stessa del colesterolo, capaci di dare origine agli ossisteroli. Questi composti a 27 atomi di carbonio sono stati studiati approfonditamente per il loro coinvolgimento nella patogenesi di malattie degenerative umane caratterizzate da infiammazione cronica, come l’aterosclerosi, la malattia di Alzheimer o le malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI). È stato ampiamente dimostrato che gli ossisteroli di origine alimentare interferiscono con l’omeostati dell’epitelio intestinale, inducendo infiammazione della mucosa e contribuendo all’alterazione della struttura e della funzione della barriera intestinale stessa. In questo studio, sono state utilizzate cellule di adenocarcinoma del colon, CaCo-2, differenziate verso un fenotipo simil-enterocita. Le cellule sono state trattate con una miscela di ossisteroli rappresentativa di una dieta ipercolesterolica (7-chetocolesterolo, 5α, 6α- e 5β, 6β-epossicolesterolo, 7α- e 7β-idrossicolesterolo) ad una concentrazione finale di 60 µM. La potenziale capacità degli ossisteroli di origine alimentare di indurre instabilità della barriera intestinale è stata valutata in termini di attivazione della metalloproteasi (MMP)-2 e -9 (zimografia), enzimi correlabili con cambiamenti nell’interazione epitelio-matrice cellulare e con modificazioni delle giunzioni strette. Anche un'aumentata apoptosi può giocare un ruolo importante nel danneggiamento della barriera intestinale. Per questo motivo sono stati analizzati, mediante Western Blotting, i livelli della proteina pro-apoptotica Bax e della proteina anti-apoptotica Bcl-xL, inseguito al trattamento con gli ossisteroli. Il trattamento delle cellule differenziate con la miscela è responsabile di un'aumentata attività della MMP-2 e della MMP-9. Così come è correlabile con un aumento nei livelli proteici di Bax e una corrispettiva riduzione dei livelli proteici di Bcl-xL. Sia nel caso delle MMP, che in quello delle proteine apoptotiche si è osservato un recupero dei normali livelli funzionali inseguito al pretrattamento con uno specifico inibitore chimico delle MMP. Una modulazione di questi stessi segnali, responsabili di una marcata destabilizzazione della barriera intestinale, è emersa successivamente al pretrattamento delle CaCo-2 differenziate con estratti digeriti delle bucce delle fave di cacao (BFC). Una riduzione nei livelli di attivazione delle MMP e un ristabilirsi dei normali livelli apoptotici è stato osservato anche in associazione al trattamento delle cellule con estratti di gelato al cioccolato arricchito con estratti di BFC. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi, infatti, l’attenzione è stata focalizzata sulla possibilità di sfruttare le proprietà benefiche di quello che è sempre stato considerato uno scarto nell’industria del cacao. L’elevata concentrazione di molecole biologicamente attive, come i polifenoli, dotate di capacità antiossidanti e antiinfiammatorie potrebbe essere responsabile della regolazione negativa sull’attivazione delle MMP e dell’apoptosi indotta dalla miscela di ossisteroli. Il positivo impatto biologico di questi composti di scarto industriale potrebbe rappresentare un valido approccio nello sviluppo di strategie per la loro valorizzazione come componenti di cibi funzionali, come ad esempio il gelato, nonché una grande opportunità per ridurne l’impatto ambientale sfruttando la possibilità di un loro riciclo.