Multidrug resistance (MDR) is one of the most impacting problems correlated to cancer relapses; its occurrence is provoked by various events such as the enhanced drug efflux by P-glycoprotein (P-gp). Among the chemotherapeutic agents, doxorubicin (Doxo) is an anticancer drug used for treating various tumour types, even if its use is associated to side effects and chemoresistance due to P-gp overexpression. A promising approach is sonodynamic treatment (SDT), which combines low-intensity ultrasound (US) with a chemical agent responsive to US (sonosensitiser) in the presence of oxygen (Costley et al., 2015). These elements together trigger cytotoxicity in tumour cells, leading to ROS production and cancer cell killing. In this thesis project, it was investigated the efficacy of SDT by using Doxo as sonosensitiser, in two resistant cancer cell lines, A2780/ADR and HT-29/ADR, representing in vitro models chemoresistant cancers. It was verified their resistant phenotype by cytofluorimetric analyses using calcein-AM, a substrate of P-gp. It was evaluated the Doxo cytotoxicity and uptake for choosing the proper conditions for the experimental treatments: data pointed out a reduced internalisation in A2780/ADR and HT-29/ADR cells, compared to their wild-type counterparts. Results confirmed as the P-gp overexpression in resistant cells was responsible for the Doxo reduced intracellular concentrations and cytotoxicity, and Doxo 0.5 µM for A2780/ADR cells and 1 µM for HT-29 cells were selected to perform SDT. The sonodynamic treatment of A2780/ADR cells induced a slight reduction of cell proliferation, while SDT of HT-29/ADR cells determined a more significant reduction of cell proliferation at 24 (p<0.01) and 72 hours (p<0.05) after SDT. It was investigated the cancer cell death induced by SDT evidencing a statistically significant reduction of live cells in both resistant cell lines (p<0.05 for A2780/ADR, p<0.001 for HT-29/ADR cells), along with a statistically significant increase (p<0.01) of apoptotic and necrotic A2780/ADR cells and a significant increase (p<0.001) of necrotic HT-29/ADR cells. These data highlight the efficacy of SDT in contrasting Doxo resistance in the two resistant cell lines. Moreover, the use of three-dimensional (3D) cell cultures has become an interesting method for representing cancer cell organisation (Lv et al., 2017); 3D cultures of HT-29 and HT-29/ADR were carried out as spheroids. The concentrations of Doxo for 3D sonodynamic experiments were chosen after the assessment of its uptake in spheroids for both cell lines. Further studies will be carried out for setting the US parameters, performing SDT and verifying the efficacy in HT-29 and HT-29/ADR spheroids. In conclusion, SDT effectiveness in treating 2D resistant cells promotes SDT as an interesting approach for treating cancer and overcoming MDR, evidencing how the resistant phenotype could undergo SDT with promising results. References Costley, D., Mc Ewan, C., Fowley, C., McHale, AP., Atchison, J., Nomikou, N., Callan, JF. Treating cancer with sonodynamic therapy: a review. Int J Hyperthermia. 2015; 31(2):107-17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., & Xu, X. Threedimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 2017; 14, 6999-7010.
La resistenza multi-farmaco (MDR) è fra i problemi più impattanti in ambito tumorale ed è causata ad una serie di eventi, come l’aumento dell’efflusso dei chemioterapici, ad opera della P-glicoproteina (P-gp). Tra questi, la doxorubicina (Doxo) è un farmaco con diverse applicazioni terapeutiche, il cui uso è limitato dagli effetti collaterali e dall’insorgenza di resistenza per aumento dell’espressione della P-gp. Il trattamento sonodinamico (SDT) è un’innovativa strategia antitumorale che combina l’utilizzo degli ultrasuoni a bassa intensità con un sonosensibilizzante, in presenza di ossigeno (Costley et al., 2015): la loro azione sinergica induce un effetto citotossico, riconducibile agli eventi di cavitazione, produzione di radicali liberi, apoptosi. In questo progetto di tesi, è stata valutata l’efficacia dell’SDT, utilizzando Doxo come sonosensibilizzante in due linee tumorali umane resistenti, A2780/ADR e HT-29/ADR, che rappresentano un modello in vitro dell’MDR. È stato verificato il fenotipo resistente tramite analisi citofluorimetriche con calceina-AM, un substrato della P-gp. Sono state valutate la citotossicità e l’uptake della Doxo, per stabilire la concentrazione per l’SDT, evidenziando una ridotta internalizzazione nelle cellule resistenti rispetto alle wild-type. I dati hanno avvalorato come l’iper-espressione della P-gp determini una ridotta citotossicità e concentrazione intracellulare di Doxo; per l’SDT si è usata Doxo 0.5 µM per le A2780/ADR e Doxo 1 µM per le HT-29/ADR. In seguito, è stato analizzato l’effetto dell’SDT sulla proliferazione cellulare: nelle A2780/ADR, ha indotto una riduzione della proliferazione cellulare, mentre nelle HT-29/ADR, l’SDT è risultata maggiormente significativa, in particolare a 24 (p<0.01) e 72 ore (p<0.05) dal trattamento. È stato valutato il tipo di morte cellulare indotto dall’SDT nelle linee resistenti rispetto al controllo rilevando per entrambe una riduzione statisticamente significativa delle cellule vive (p<0.05 per A2780/ADR, p<0.001 per HT-29/ADR), insieme a un incremento significativo delle cellule apoptotiche e necrotiche (p<0.01) per A2780/ADR, e di quelle necrotiche (p<0.001) per HT-29/ADR. I risultati evidenziano l’effetto citotossico indotto dall’SDT, caratterizzato da un significativo aumento delle cellule necrotiche in entrambe le linee resistenti e delle apoptotiche in A2780/ADR. L’utilizzo di modelli tridimensionali (3D) è uno strumento per mimare l’organizzazione delle cellule tumorali (Lv et al., 2017); è stata sviluppata una coltura 3D delle HT-29 e HT-29/ADR, determinando le concentrazioni di Doxo per esperimenti futuri di sonodinamica, mediante l’analisi dell’uptake per ambo le linee cellulari. Ulteriori studi saranno necessari per stabilire i parametri per l’SDT di strutture 3D e valutarne l’efficacia. In conclusione, l'efficacia dell’SDT nel modello bidimensionale sottolinea come il trattamento possa rappresentare un’interessante strategia antitumorale per superare la resistenza alla doxorubicina. Bibliografia Costley, D., Mc Ewan, C., Fowley, C., McHale, AP., Atchison, J., Nomikou, N., Callan, JF. Treating cancer with sonodynamic therapy: a review. Int J Hyperthermia. 2015; 31(2):107-17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., & Xu, X. Three dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 2017; 14, 6999-7010.
Valutazione dell’efficacia del trattamento con ultrasuoni nel contrasto alla resistenza ai farmaci in modelli tumorali cellulari bi-e tri-dimensionali resistenti alla doxorubicina
PORCHIETTO, ELISA
2020/2021
Abstract
La resistenza multi-farmaco (MDR) è fra i problemi più impattanti in ambito tumorale ed è causata ad una serie di eventi, come l’aumento dell’efflusso dei chemioterapici, ad opera della P-glicoproteina (P-gp). Tra questi, la doxorubicina (Doxo) è un farmaco con diverse applicazioni terapeutiche, il cui uso è limitato dagli effetti collaterali e dall’insorgenza di resistenza per aumento dell’espressione della P-gp. Il trattamento sonodinamico (SDT) è un’innovativa strategia antitumorale che combina l’utilizzo degli ultrasuoni a bassa intensità con un sonosensibilizzante, in presenza di ossigeno (Costley et al., 2015): la loro azione sinergica induce un effetto citotossico, riconducibile agli eventi di cavitazione, produzione di radicali liberi, apoptosi. In questo progetto di tesi, è stata valutata l’efficacia dell’SDT, utilizzando Doxo come sonosensibilizzante in due linee tumorali umane resistenti, A2780/ADR e HT-29/ADR, che rappresentano un modello in vitro dell’MDR. È stato verificato il fenotipo resistente tramite analisi citofluorimetriche con calceina-AM, un substrato della P-gp. Sono state valutate la citotossicità e l’uptake della Doxo, per stabilire la concentrazione per l’SDT, evidenziando una ridotta internalizzazione nelle cellule resistenti rispetto alle wild-type. I dati hanno avvalorato come l’iper-espressione della P-gp determini una ridotta citotossicità e concentrazione intracellulare di Doxo; per l’SDT si è usata Doxo 0.5 µM per le A2780/ADR e Doxo 1 µM per le HT-29/ADR. In seguito, è stato analizzato l’effetto dell’SDT sulla proliferazione cellulare: nelle A2780/ADR, ha indotto una riduzione della proliferazione cellulare, mentre nelle HT-29/ADR, l’SDT è risultata maggiormente significativa, in particolare a 24 (p<0.01) e 72 ore (p<0.05) dal trattamento. È stato valutato il tipo di morte cellulare indotto dall’SDT nelle linee resistenti rispetto al controllo rilevando per entrambe una riduzione statisticamente significativa delle cellule vive (p<0.05 per A2780/ADR, p<0.001 per HT-29/ADR), insieme a un incremento significativo delle cellule apoptotiche e necrotiche (p<0.01) per A2780/ADR, e di quelle necrotiche (p<0.001) per HT-29/ADR. I risultati evidenziano l’effetto citotossico indotto dall’SDT, caratterizzato da un significativo aumento delle cellule necrotiche in entrambe le linee resistenti e delle apoptotiche in A2780/ADR. L’utilizzo di modelli tridimensionali (3D) è uno strumento per mimare l’organizzazione delle cellule tumorali (Lv et al., 2017); è stata sviluppata una coltura 3D delle HT-29 e HT-29/ADR, determinando le concentrazioni di Doxo per esperimenti futuri di sonodinamica, mediante l’analisi dell’uptake per ambo le linee cellulari. Ulteriori studi saranno necessari per stabilire i parametri per l’SDT di strutture 3D e valutarne l’efficacia. In conclusione, l'efficacia dell’SDT nel modello bidimensionale sottolinea come il trattamento possa rappresentare un’interessante strategia antitumorale per superare la resistenza alla doxorubicina. Bibliografia Costley, D., Mc Ewan, C., Fowley, C., McHale, AP., Atchison, J., Nomikou, N., Callan, JF. Treating cancer with sonodynamic therapy: a review. Int J Hyperthermia. 2015; 31(2):107-17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., & Xu, X. Three dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 2017; 14, 6999-7010.| File | Dimensione | Formato | |
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