Validazione e ottimizzazione di un nuovo test non invasivo e clinicamente fruibile per la diagnosi precoce di rigetto nel trapianto di cuore

Endomyocardial biopsy (EMB) is considered the technique of choice for the evaluation of acute rejection following cardiac transplantation. However, this procedure is invasive, subject to variability of interpretation and lacking a well-defined histological classification. An alternative to the biopsy approach is the study of free circulating DNA from the donor (dd-cfDNA), considered an early and non-invasive marker of acute rejection. In this study, a new digital PCR droplet assay (ddPCR) was validated and optimized for the quantification of dd-cfDNA in heart transplant rejection monitoring, based on the HLA mismatch between donor and recipient, which uses a panel of specific probes for allelic variants of the HLA-DRB1 gene. The patient cohort analyzed consisted of 19 adult subjects, predominantly male (78.9%), transplanted between July 2019 and June 2020. In general, dd-cfDNA levels increased within the first week after transplant, presumably due to ischemia-reperfusion injury, in line with the data in the literature. Subsequently, the dd-cfDNA values ​​found stabilize below 1% in conditions of good cardiac function and absence of rejection (with BEM evaluation of 0R), while in patients who develop acute rejection (with BEM evaluation of 1R) ) the percentage increases significantly with a p value of 0.0001. In contrast, in patients who develop infectious and cardiovascular complications not related to rejection, there are no significant increases in dd-cfDNA levels. This study confirms that dd-cfDNA represents a valid biomarker of acute rejection in heart transplantation. Furthermore, the dd-PCR assay based on the HLA mismatch between donor and recipient and validated here, is a sensitive, fast and affordable tool for monitoring rejection.

La biopsia endomiocardica (BEM) è considerata la tecnica di elezione per la valutazione del rigetto acuto a seguito di trapianto cardiaco. Questa procedura tuttavia è invasiva, soggetta a variabilità di interpretazione e mancante di una classificazione istologica ben definita. Un’ alternativa all’approccio bioptico è lo studio del DNA libero circolante proveniente dal donatore (dd-cfDNA), considerato un marcatore precoce e non invasivo di rigetto acuto. In questo studio è stato validato e ottimizzato un nuovo saggio di droplet digital PCR (ddPCR) per la quantificazione del dd-cfDNA nel monitoraggio del rigetto nel trapianto cardiaco, basato sul mismatch HLA tra donatore e ricevente, il quale sfrutta un pannello di sonde specifiche per le varianti alleliche del gene HLA-DRB1. La coorte di pazienti analizzata è composta da 19 soggetti adulti, prevalentemente di sesso maschile (78,9%), trapiantati tra luglio 2019 e giugno 2020. In generale, i livelli di dd-cfDNA risultano aumentati entro la prima settimana dal trapianto, presumibilmente a causa del danno da ischemia-riperfusione, in linea con i dati presenti in letteratura. Successivamente i valori di dd-cfDNA riscontrati si stabilizzano al di sotto dell’1% in condizioni di buona funzionalità cardiaca e assenza di rigetto (con valutazione alla BEM di 0R), mentre nei pazienti che sviluppano rigetto acuto (con valutazione alla BEM di 1R) la percentuale aumenta significativamente con un p value pari a 0,0001. Al contrario, nei pazienti che sviluppano complicanze infettive e cardiovascolari non correlate a rigetto, non vi sono incrementi significativi dei livelli di dd-cfDNA. Questo studio conferma che il dd-cfDNA rappresenta un valido biomarcatore di rigetto acuto nel trapianto cardiaco. Inoltre, il saggio di dd-PCR basato sul mismatch HLA tra donatore e ricevente e qui validato, risulta essere uno strumento sensibile, rapido ed economicamente accessibile per il monitoraggio del rigetto.