Ruolo del fattore di trascrizione C/EBP-beta nella resistenza al cisplatino nel carcinoma polmonare non a piccole cellule

Introduzione e scopo. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è il sottotipo più comune di cancro al polmone. Il trattamento di prima linea prevede regimi di chemioterapia basati sui derivati del platino, ma la percentuale di successo è bassa a causa dello sviluppo della resistenza ai farmaci. I trasportatori ATP Binding Cassette (ABC), in particolare ABCB1 e ABCC1, sono le principali proteine che causano l’efflusso del cisplatino, limitandone l'accumulo intracellulare e la sua funzione tossica. Abbiamo precedentemente dimostrato che il fattore di trascrizione CAAT Enhancer Binding Protein/β (C/EBP-β) determina la resistenza al cisplatino nei tumori solidi modulando la trascrizione di ABCB1. Tuttavia, C/EBP-β ha funzioni pleiotropiche e recenti evidenze hanno mostrato il suo ruolo chiave come induttore del ricablaggio metabolico. Lo scopo di questa tesi è indagare con quali meccanismi C/EBP-β determina la resistenza del NSCLC al cisplatino. Metodi. A partire da 6 linee cellulari umane di NSCLC abbiamo prodotto i cloni che sovraesprimono stabilmente le due principali isoforme di splicing di C/EBP-β: C/EBP-β LAP e C/EBP-β LIP. I livelli di ABCB1 e ABCC1 sono stati valutati mediante RT-PCR e immunoblotting. La vitalità cellulare è stata misurata tramite spettrofotometria e il ciclo cellulare mediante citometria a flusso. I livelli di fosfo-H2AX, un indice di danno al DNA, sono stati rilevati mediante immunofluorescenza. I cambiamenti nel metabolismo cellulare sono stati valutati mediante analisi del metaboloma e del lipidoma, tramite HPLC/MS e LC/MS. Risultati. Le cellule che esprimono LAP avevano una maggiore quantità di ABCB1 e ABCC1 e una maggiore IC50 rispetto al cisplatino, mentre la sovraespressione di LIP ha indotto il fenotipo opposto. Nelle prime due linee cellulari resistenti al cisplatino si è visto che la sovraespressione di LAP protegge le cellule dall'arresto della fase S indotto dal farmaco e riduce il numero di foci fosfo-H2AX, mentre la sovraespressione di LIP ha esacerbato questi eventi. I cambiamenti metabolici più significativi nelle cellule che sovraesprimono LIP rispetto a LAP sono stati la diminuzione dei precursori del glutatione, del ciclo dell'acido tricarbossilico e degli intermedi dell’ossidazione degli acidi grassi, della glutammina e dei metaboliti degli aminoacidi ramificati. Inoltre, le cellule con sovraespressione di LIP avevano livelli inferiori di lipidi e fosfolipidi neutri e di acidi grassi saturi (mono e polinsaturi), ma valori più elevati di acidi grassi a catena lunga ramificati. Conclusioni. Abbiamo dimostrato che la prevalenza di C/EBP-β LIP o LAP può indurre sensibilità o resistenza al cisplatino nel NSCLC. I meccanismi pleiotropici spiegano questo fenotipo. Innanzitutto, C/EBP-β LIP induce una down-regolazione dei principali trasportatori ABC che causano l’efflusso del cisplatino e aumenta i danni al DNA provocati dal farmaco. In secondo luogo, C/EBP-β LIP riduce i livelli dei metaboliti con ruolo antiossidante e di quelli responsabili della produzione di energia mitocondriale. Causa anche una riduzione delle molecole derivanti dagli amminoacidi e altera la composizione delle membrane. Questi cambiamenti possono creare vulnerabilità metaboliche che potrebbero essere sfruttate da specifici modificatori metabolici per migliorare la sensibilità al cisplatino nel NSCLC.