Prove crociate di compatibilità pre trapianto: validazione di un nuovo metodo di analisi citofluorimetrica

Compatibility crossmatching methods represent a fundamental analysis carried out by immunogenetics laboratories to ensure the suitability and transplantability of an organ from a donor to a recipient. This technique aims to identify, among a pool of possible recipients, those who are not suitable for receiving a transplant. The compatibility between donor and recipient is determined by the HLA system, an antigen complex expressed on the cells of our organism that presents peptidic antigens to T cells. When the HLA + peptide complex binds T lymphocytes, it triggers an immune response both cellular and humoral, in order to eliminate the cell perceived as non-self. HLA antigens are extremely variable among the population, this diversity underlies graft rejection. Following the exposure to immunizing events such as transplants, transfusions, and pregnancies/abortions, the immune system may encounter foreign cells that express non-self HLA molecules, building an immune response and an immunological memory represented by antibodies directed against foreign HLA antigens. The presence of these antibodies is shown by compatibility crossmatching methods, and it represents a reason of exclusion from kidney transplantation. The gold standard for crossmatching is flow cytometry, which measures the bound of IgG or IgM antibodies to T or B lymphocytes. The method is based on the presence of a laser capable of exciting, at different wavelengths, fluorochromes that are conjugated to monoclonal antibodies specific for T or B cells. The purpose of my thesis, held at the Service of Immunogenetics and Biology of Transplants of Città della Salute e della Scienza di Torino, during the last year, was to develop and validate a novel cytofluorimetry method that leads to the combination of different fluorochromes with a significant advantage in terms of number of cells used and timing of analysis. The successful validation has allowed the introduction of the new protocol in the service of Immunogenetics and Biology of Transplants of Città della Salute e della Scienza di Torino.

Le prove crociate di compatibilità rappresentano un’analisi fondamentale svolta dai laboratori di immunogenetica per assicurare l’idoneità e la trapiantabilità di un organo da un donatore a un ricevente. Questa tecnica ha lo scopo di individuare, tra un pool di possibili riceventi, coloro che presentano caratteristiche tali da risultare non idonei a ricevere un trapianto. La compatibilità tra donatore e ricevente è determinata dal sistema HLA, un complesso di antigeni presenti sulle cellule del nostro organismo il cui compito è quello di presentare gli antigeni peptidici ai linfociti T. Il legame tra complesso HLA+peptide e linfocita T scatena una risposta immunitaria sia cellulare che umorale volta all’eliminazione della cellula percepita come estranea. Gli antigeni HLA sono estremamente variabili nella popolazione ed è proprio questa diversità alla base del rigetto d’organo. In seguito all’esposizione ad eventi immunizzanti quali trapianti, trasfusioni, e gravidanze/aborti, il sistema immunitario può venire a contatto con cellule estranee che esprimono molecole HLA diverse da quelle self, costruendo una risposta immunitaria e soprattutto una memoria immunologica rappresentata da anticorpi diretti contro gli antigeni HLA estranei. La presenza di questi anticorpi viene evidenziata con le prove crociate di compatibilità e rappresenta motivo di esclusione dal trapianto di rene. La metodica di scelta per le prove crociate è la citofluorimetria che misura il legame di anticorpi di classe IgG o IgM a linfociti T o B. Il principio sfrutta la presenza di un laser in grado di eccitare, a lunghezze d’onda diverse, fluorocromi che sono coniugati ad anticorpi monoclonali specifici per i linfociti T o B. Lo scopo della mia tesi, svolta presso il Servizio di Immunogenetica e Biologia dei Trapianti della Città della Salute e della Scienza di Torino, nel corso dell’ultimo anno, è stato quello di mettere a punto e validare un nuovo protocollo operativo per il cross-match in citofluorimetria che porti alla combinazione di fluorocromi diversi con un vantaggio significativo in termini di numero di cellule impiegate e tempi di analisi. La validazione avvenuta con successo ha permesso l’introduzione del nuovo protocollo nel servizio di Immunogenetica e Biologia dei Trapianti della Città della Salute e della Scienza di Torino.