Ruolo delle molecole del Quorum Sensing derivate da batteri Gram-negativi nei meccanismi di danno renale acuto (AKI) correlato a sepsi

Bacterial Quorum Sensing (QS) molecules are a communication system between bacteria of the same species and competition between different species. The most studied QS are those of Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas Aeruginosa. This bacterium mainly produces two types of QS: homoserine lactones (HSL) such as C4-HSL and quinolones (HQ). Recently, it has been discovered that these molecules also have a biological effect on eukaryotic cells and are carried by bacterial extracellular vesicles (OMVs). P. Aeruginosa is among the main causes of sepsis, especially by urinary tract infections, infected surgical wounds and lower respiratory tract infections. One of the most feared complications of sepsis is acute kidney injury (AKI), a cause of in-hospital mortality and worsening prognosis in the medium and long term. Among the most promising therapies for the treatment of AKI during sepsis from Gram-negative bacteria, there is renal replacement therapy (RRT) with Polymyxin B in haemoperfusion (Toraymyxin®), a filter capable of removing from the bloodstream the lipopolysaccharide endotoxin (LPS). The purposes of the study were to evaluate: 1) the presence of QS in patients with AKI in the course of sepsis from Gram-negative bacteria; 2) the ability of RRT with Toraymyxin® to remove QS; 3) the biological effect of QS on human renal epithelial tubular cells (TEC) in vitro. Case Studies and Methods We enrolled 29 patients with AKI with Gram-negative sepsis, 17 of whom had P. aeruginosa infection. All patients underwent two sessions of Toraymyxin® therapy. We searched for QS molecules (C4-HSL, 3O-C12-HSL, HHQ) in patients serum through mass spectrometry. We used Toraymyxin® mini-cartridges to study removal dynamics in QS enriched solutions. We used bacterial supernatants of P. aeruginosa knockout for the synthesis of C4-HSL. On TEC in vitro, we studied the biological effect of C4-HSL. Results Of 17 patients with P. aeruginosa sepsis, 13 were positive for the C4-HSL molecule, 15 for HHQ and only 3 for 3O-C12-HSL. These molecules were not found in the 12 patients with other Gram-negative sepsis. SQs were also found among the serum extracellular vesicles (EV) of some of the patients. RRT with Toraymyxin® reduced C4-HSL and 3O-C12-HSL concentrations by 5-fold, but not HHQ. This finding was confirmed with the hemoperfusion of mini-cartridges with the physiological solution or whole blood enriched with C4-HSL. Additionally, RRT with Toraymyxin® on all patients removed 50% of circulating serum IVs. On TECs cultured in vitro, we observed that C4-HSL has a cytotoxic and pro-apoptotic effect. TECs lost polarity and cellular interaction mediated by the ZO-1 molecule. The TECs lost the expression of Megalin, a transporter of the proximal renal tubule essential for the absorption of various metabolites. In addition, there was an increase in oxidative stress and mitochondrial damage with loss of mitochondrial biogenesis. TECs also acquired a pro-inflammatory phenotype by releasing cytokines and NGAL, a marker of AKI. Incubation with C4-HSL-free bacterial supernatants did not cause the biological effects previously described. At the same time, co-incubation with LPS amplified the effects of C4-HSL on TECs. Conclusions C4-HSL and HHQ are very sensitive markers of P. aeruginosa infection. Note that QS are present in circulating EVs. Toraymyxin® reduces blood concentrations of C4-HSL but not HHQ and takes 50% of circulating EVs. The synergistic effect of QS and LPS on TECs suggests the hypothesis of a new pathophysiological mechanism of AKI in the course of sepsis. The development of RRT methods aimed at removing QS and EVs could improve the course of AKI in the course of sepsis.

Le molecole del Quorum Sensing (QS) sono un sistema di comunicazione tra batteri della stessa specie e di competizione tra batteri di specie diversa. Le QS più studiate sono quelle di batteri Gram-negativi, come Pseudomonas Aeruginosa. Questo batterio produce principalmente due tipi di QS: gli omoserina lattoni (HSL) come C4-HSL e i chinoloni (HQ). Recentemente, si è scoperto che queste molecole hanno un effetto biologico anche su eucarioti e sono veicolate da vescicole extracellulari batteriche. P. Aeruginosa è tra le principali cause di sepsi. Una delle complicanze più temibili della sepsi è il danno renale acuto (AKI), che ha un'alta mortalità intraospedaliera e pessima prognosi a medio e lungo termine. Tra le terapie più promettenti per il trattamento dell’AKI in corso di sepsi da batteri Gram-negativi, vi è la terapia sostitutiva renale (RRT) con Polimixina B in l’emoperfusione (Toraymyxin®) che è un filtro in grado di rimuovere l’endotossina lipopolisaccaride (LPS). Gli scopi dello studio sono stati di valutare: 1) la presenza di QS in pazienti affetti da AKI in corso di sepsi da Gram-negativi; 2) la capacità della RRT con Toraymyxin® nel rimuovere i QS; 3) l’effetto biologico di QS su cellule tubulari epiteliali renali umane (TEC) in vitro. Casistica e Metodi Abbiamo arruolato 29 pazienti con AKI in corso di sepsi da batteri Gram-negativi; 17 di questi avevano una infezione da P. Aeruginosa. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a due sessioni di terapia con Toraymyxin®. Abbiamo ricercato le molecole del QS (C4-HSL, 3O-C12-HSL, HHQ) nel siero dei pazienti mediante metodica di spettrometria di massa. Abbiamo utilizzato: minicartucce di Toraymyxin® per studiare la dinamica di rimozione in soluzioni arricchite di QS, surnatanti batterici di P. Aeruginosa knockout per la sintesi di C4-HSL e TEC in vitro su cui abbiamo studiato l’effetto biologico di C4-HSL. Risultati Su 17 pazienti con sepsi da P. Aeruginosa, 13 erano positivi per la molecola C4-HSL, 15 per HHQ e solo 3 per 3O-C12-HSL. Nei 12 pazienti con sepsi da altri Gram-negativi non si riscontravano queste molecole. I QS erano riscontrabili anche tra le vescicole extracellulari (EV) sieriche di alcuni dei pazienti. La RRT con Toraymyxin® ha ridotto di 5 volte le concentrazioni la C4-HSL e di 3O-C12-HSL, ma non di HHQ. Questo dato era confermato con l’emoperfusione di minicartucce con soluzione fisiologica e sangue intero arricchito di C4-HSL. Inoltre, La RRT con Toraymyxin® su tutti i pazienti ha rimosso il 50% delle EV sieriche circolanti. Su TEC coltivate in vitro abbiamo osservato che C4-HSL ha un effetto citotossico e pro-apoptotico. Le TEC perdevano la polarità e l’interazione cellulare mediato dalla molecola ZO-1. Le TEC perdevano l’espressione di megalina, un trasportatore del tubulo prossimale renale importante per l’assorbimento di vari metaboliti. Inoltre, si osservava un aumento dello stress ossidativo e del danno mitocondriale con perdita della biogenesi mitocondriale. Le TEC acquisivano inoltre un fenotipo pro-infiammatorio rilasciando citochine e NGAL, un marcatore di AKI. L’incubazione con surnatanti batterici privi di C4-HSL non causava gli effetti biologici precedentemente descritti, mentre la co-incubazione con LPS ha amplificato gli effetti di C4-HSL sulle TEC. Conclusioni C4-HSL e HHQ sono marcatori molto sensibili di infezione da P. Aeruginosa. Da notare che i QS sono presenti nelle EV circolanti. Toraymyxin® riduce le concentrazioni ematiche di C4-HSL ma non HHQ e adosrbe il 50% di EV circolanti. L’effeto sinergico di QS e LPS su TEC suggerisce l’ipotesi di un nuovo meccanismo fisiopatologico di AKI in corso di sepsi. Lo sviluppo di metodiche di RRT volte a rimuovere QS e EV, potrebbe migliorare il decorso dell’AKI in corso di sepsi.