Alaria alata is an intestinal trematode of carnivores with a three-host life cycle involving freshwater mollusks as first intermediate hosts, amphibians as second intermediate hosts and canids and other European carnivores, including red foxes (Vulpes vulpes), as definitive hosts. Furthermore, a broad range of vertebrate paratenic hosts, including wild boars (Sus scrofa) and humans, can extend the life cycle. In this context, human infections can be associated with the consumption of raw or undercooked game meat or frog legs. Therefore, A. alata can be considered a potential threat for human health, in a One health perspective, needing a surveillance programme, to monitor the presence of the parasite in wildlife. In 2015, 21 out of 100 foxes sampled in Piedmont region resulted positives to the presence of parasites belonging to the Alariidae family. The present study aimed to further characterize the foxes trematodes in order to get the species identification; besides, the occurrence of A. alata mesocercariae in wild boars in Piedmont was investigated to assess the risk of contracting alariosis for game meat consumers. In January 2020, 13 red foxes (Vulpes vulpes) were collected in the surrounding area of Vercelli; the small intestines were examined by sedimentation and counting technique and the isolated trematodes were morphologically described; in order to achieve the species identification, a molecular characterization was performed by applying the A. alata specific PCR described by Riehn et al. (2010) and by the partial amplification and sequencing of the 28S, 18S, COI, ITS1 and ITS2 genes; the sequences were subjected to phylogenetic analysis. Furthermore, diaphragm, larynx, tongue and fatty and glandular tissue from the cheek region of 55 wild boar carcasses were sampled and tested for the presence of A. alata mesocercariae applying the A. alata mesocercariae Migration Technique (AMT). The presence of trematodes belonging to the family Alariidae was detected in all the collected fox carcasses. However, PCR products amplified through the use of the A. alata specie-specific primer set showed a percentage of identity of 95,4% with A. alata Genbank entries; besides, 18S rDNA and COI mtDNA fragments showed 97,6% and 86,5% similarity to any sequence deposited in Genbank, respectively. Furthermore, ITS1 and ITS2 regions revealed a percentage of identity of 97-98% with Pharingostomum cordatum, a poorly described member of the Alariidae family, thus questioning the genus of the isolated trematodes. In conclusion, considering the morphological features and the sequences percentage of identity, it can be stated that the isolated trematodes belong to the genus Pharingostomum. However, considering the lack of data on the P. cordatum species, which is reported primarily in Asia and whose cycle involves cats as definitive hosts, further investigations are needed to characterize this cryptic genus and to evaluate the possible presence of a putative new species. None of the wild boar carcasses sampled during this study tested positive for the presence of A. alata mesocercariae; nevertheless, further studies are required to consider negligible the risk for the game meat consumer.
Alaria alata è un trematode intestinale che possiede un ciclo a tre ospiti: primo e secondo ospite intermedio sono rappresentati, rispettivamente, da un mollusco d’acqua dolce appartenente alla famiglia Planorbidae e da un anfibio, mentre l’ospite definitivo è rappresentato da canidi e altri carnivori europei, tra cui la volpe rossa (Vulpes vulpes). Tale parassita risulta importante nell’ambito della salute pubblica per il suo potenziale zoonotico in forma di mesocercaria; le mesocercarie possono infestare, a seguito di ingestione, diversi ospiti paratenici, tra i quali si annoverano il cinghiale (Sus scrofa) e l’uomo. La presente tesi si ricollega ad un precedente studio, condotto nel 2015, il quale, a seguito del campionamento di 100 volpi rosse in Piemonte e al riscontro dell’infestazione di 21 degli esemplari abbattuti, aveva portato all’identificazione dei parassiti rinvenuti come appartenenti alla famiglia Alariidae. Alla luce della mancanza di dati sufficienti per giungere ad un’identificazione di specie, il presente studio si è proposto di approfondire le indagini morfologiche e molecolari sui trematodi della famiglia Alariidae presenti nelle volpi del territorio piemontese e di indagare la presenza della parassitosi nella popolazione di cinghiali al fine di valutare il rischio di contrarre l’alariosi per i consumatori di carne di selvaggina. Nell’ambito della presente ricerca sono state campionate 13 volpi rosse presso il comune di Sali Vercellese (VC); a seguito dell’esame della mucosa del piccolo intestino, i parassiti assimilabili ad A. alata rinvenuti, sono stati prelevati e sottoposti ad identificazione morfologica, mediante compressione e fissazione in AFA, colorazione in rosso carminio e utilizzo delle chiavi dicotomiche standard, e ad identificazione molecolare, tramite amplificazione parziale e sequenziamento dei geni 28S, 18S, COI e delle regioni ITS1 e ITS2. Le sequenze ottenute sono state successivamente sottoposte ad analisi filogenetica. Sono stati inoltre campionati 55 cinghiali, provenienti dalle province di Vercelli e Novara; i campioni prelevati, rappresentati da grasso retroperitoneale, diaframma, lingua, laringe e muscoli masticatori, sono stati processati con la tecnica dell’Alaria alata mesocercariae Migration Technique (AMT) e osservati allo stereomicroscopio. Dal sequenziamento dei prodotti di amplificazione sono state riscontrate divergenze fra le sequenze ottenute nel presente studio e quelle depositate su Genbank; nonostante l’esecuzione della PCR specifica per A. alata sul gene 28S abbia dato esito positivo, al sequenziamento la percentuale di identità riscontrata per A. alata è risultata essere del: 95,36% per il gene 28S, 97,60% per il gene 18S, 86,51% per il gene COI; l’analisi delle regioni ITS1 e ITS2 ha mostrato un riscontro di identità del 97-98% tra i trematodi esaminati e Pharingostomum cordatum e, in particolare, l’esame della regione ITS2 ha evidenziato la mancanza d’identità con Alaria spp. Pertanto si è giunti alla conclusione che i trematodi esaminati non appartengano al genere Alaria, bensì al genere Pharyngostomum. Considerato che P. cordatum è segnalato in Asia, presenta il gatto come ospite definitivo e possiede un’identità del 97-98% con le sequenze ottenute, ulteriori indagini sono in corso per valutare se i parassiti esaminati appartengano ad una nuova specie. Nessuno dei cinghiali esaminati è risultato positivo alla presenza di mesocercariae di A. alata.
Specie pseudo-criptiche tra i trematodi a trasmissione alimentare: il caso di Alaria alata.
AGRESTI, SILVIA
2020/2021
Abstract
Alaria alata è un trematode intestinale che possiede un ciclo a tre ospiti: primo e secondo ospite intermedio sono rappresentati, rispettivamente, da un mollusco d’acqua dolce appartenente alla famiglia Planorbidae e da un anfibio, mentre l’ospite definitivo è rappresentato da canidi e altri carnivori europei, tra cui la volpe rossa (Vulpes vulpes). Tale parassita risulta importante nell’ambito della salute pubblica per il suo potenziale zoonotico in forma di mesocercaria; le mesocercarie possono infestare, a seguito di ingestione, diversi ospiti paratenici, tra i quali si annoverano il cinghiale (Sus scrofa) e l’uomo. La presente tesi si ricollega ad un precedente studio, condotto nel 2015, il quale, a seguito del campionamento di 100 volpi rosse in Piemonte e al riscontro dell’infestazione di 21 degli esemplari abbattuti, aveva portato all’identificazione dei parassiti rinvenuti come appartenenti alla famiglia Alariidae. Alla luce della mancanza di dati sufficienti per giungere ad un’identificazione di specie, il presente studio si è proposto di approfondire le indagini morfologiche e molecolari sui trematodi della famiglia Alariidae presenti nelle volpi del territorio piemontese e di indagare la presenza della parassitosi nella popolazione di cinghiali al fine di valutare il rischio di contrarre l’alariosi per i consumatori di carne di selvaggina. Nell’ambito della presente ricerca sono state campionate 13 volpi rosse presso il comune di Sali Vercellese (VC); a seguito dell’esame della mucosa del piccolo intestino, i parassiti assimilabili ad A. alata rinvenuti, sono stati prelevati e sottoposti ad identificazione morfologica, mediante compressione e fissazione in AFA, colorazione in rosso carminio e utilizzo delle chiavi dicotomiche standard, e ad identificazione molecolare, tramite amplificazione parziale e sequenziamento dei geni 28S, 18S, COI e delle regioni ITS1 e ITS2. Le sequenze ottenute sono state successivamente sottoposte ad analisi filogenetica. Sono stati inoltre campionati 55 cinghiali, provenienti dalle province di Vercelli e Novara; i campioni prelevati, rappresentati da grasso retroperitoneale, diaframma, lingua, laringe e muscoli masticatori, sono stati processati con la tecnica dell’Alaria alata mesocercariae Migration Technique (AMT) e osservati allo stereomicroscopio. Dal sequenziamento dei prodotti di amplificazione sono state riscontrate divergenze fra le sequenze ottenute nel presente studio e quelle depositate su Genbank; nonostante l’esecuzione della PCR specifica per A. alata sul gene 28S abbia dato esito positivo, al sequenziamento la percentuale di identità riscontrata per A. alata è risultata essere del: 95,36% per il gene 28S, 97,60% per il gene 18S, 86,51% per il gene COI; l’analisi delle regioni ITS1 e ITS2 ha mostrato un riscontro di identità del 97-98% tra i trematodi esaminati e Pharingostomum cordatum e, in particolare, l’esame della regione ITS2 ha evidenziato la mancanza d’identità con Alaria spp. Pertanto si è giunti alla conclusione che i trematodi esaminati non appartengano al genere Alaria, bensì al genere Pharyngostomum. Considerato che P. cordatum è segnalato in Asia, presenta il gatto come ospite definitivo e possiede un’identità del 97-98% con le sequenze ottenute, ulteriori indagini sono in corso per valutare se i parassiti esaminati appartengano ad una nuova specie. Nessuno dei cinghiali esaminati è risultato positivo alla presenza di mesocercariae di A. alata.| File | Dimensione | Formato | |
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