Eggplant (S. melongena L.) breeding could be directed towards the resistance to abiotic and biotic stresses and the improvement of fruit quality through research of useful alleles in wild relatives and traditional breeding approaches, but also by using different genetic transformation tools. Genome editing technologies emerged as the most promising strategy since they provide the possibility to obtain plants with desired characteristics in a reduced time window inducing gene target mutations. Among these technologies, the CRISPR/Cas system is the most effective but there is only on example in eggplant so far. Moreover, eggplant’s in vitro regeneration is strongly dependent on the type of explant and on the considered genotype. The aim of my Thesis work was to apply two different genome editing protocols in eggplant on the cv. Black Beauty targeting the PDS gene, chosen because of the photobleaching phenotype its deactivation may cause. The first approach consisted in the use of a stable transformation protocol based on a viral construct containing Cas9 gene and a gRNA targeting PDS. Two different concentrations of acetosyringone were used in the co-colture phase: 50 µM (condition ST1) and 200 µM (condition ST2). Two different media were tested: GF medium, containing the cytokinin ZN (zeatin riboside), and K medium, containing the cytokinin BAP (6-benzyleaminopurine) for the induction phase. Both media contained GA3 (gibberellic acid) in the elongation step, while rooting media included the auxin IBA (indole-3-butyric acid). The best regeneration rate was obtained with the GF medium in both transformation trial (ST1 and ST2): the percentage of regenerated sprouts was 44% from cotyledons and 28% from hypocotyls (0% and 13% respectively onto the K medium) in ST1, and 81% from cotyledons and 53% from hypocotyls (11% and 8% respectively onto the K medium) in ST2. The number of regenerated plants onto the GF medium was 61 in the ST1 condition and 91 in the ST2 condition, while only 3 plants were successfully regenerated onto K medium in the ST1 condition. Among 30 selected plants, 27 resulted positive to the transgene integration and the editing efficiency was evaluated through Sanger sequencing and TIDE analysis. It was possible to observe the complete photobleaching phenotype only in two regenerated plantlets belonging to ST2 trial. The second approach was based on an innovative strategy, which allows to obtain de novo induction of edited meristems starting from emerging seedlings soaked into a solution of a transformed strain of A. tumefaciens carrying growth regulators. Two combination of growth regulators were tested: WUSCHEL+SHOOT MERISTEMLESS and WUSCHEL + ISOPENTENYL TRANSFERASE, whose function is to regulate the maintenance of the stem cells niche. Three gRNAs targeting PDS were designed. Callus-like structures formed starting from most of cotyledons, while the regeneration of whole plants occurred starting from buds. Among 34 plants tested, 32 resulted positive to the presence of the transgene and the editing efficiency was evaluated at the target loci. My Thesis results highlighted an excellent regeneration efficiency in eggplant, useful for next transformation approaches, and a limited gene editing efficiency. S. melongena appeared to be not very sensitive to the ectopic expression of growth regulators, for this reason it would be necessary to find new innovative transformation protocols.
Il miglioramento genetico della melanzana (S. melongena L.) può essere finalizzato alla resistenza a stress abiotici e biotici o al miglioramento delle qualità dei frutti mediante la ricerca di alleli utili nei progenitori selvatici o mediante il breeding tradizionale, ma anche sfruttando la trasformazione genetica. Le tecnologie di genome editing sono risultate le più promettenti dal momento in cui offrono la possibilità di ottenere piante con caratteristiche desiderate in minor tempo inducendo mutazioni target. Il sistema di editing CRISPR/Cas è il più efficiente ed è stato applicato con successo solo una volta in melanzana, la cui rigenerazione in vitro dipende fortemente dal tipo di espianto e dal genotipo. Lo scopo di questa Tesi è di utilizzare due protocolli di genome editing, basati sulla trasformazione mediata da A. tumefaciens, per la trasformazione della cv. Black Beauty, utilizzando come target il gene PDS, scelto per il fenotipo bianco che può essere causato dalla sua inattivazione. Il primo approccio di trasformazione si basava su un protocollo di trasformazione stabile usando costrutti virali contenenti il gene Cas9 e un gRNA avente PDS come target. Sono state usate due concentrazioni di acetosyringone nella fase di co-coltura: 50 µM (condizione ST1) and 200 µM (condizione ST2). Sono stati usati due mezzi di rigenerazione: GF con ZN (zeatina riboside) e K con BAP (6-benzilamminopurina). Entrambi i mezzi contenevano GA3 (acido gibberellico) nella fase di elongazione, mentre i mezzi di radicazione contenevano IBA (acido 3-indol-butirrico). Il miglior tasso di rigenerazione è stato osservato con il mezzo GF in entrambe le condizioni di trasformazione (ST1, ST2): la percentuale di rigenerazione di germogli era del 44% da cotiledoni, 28% da ipocotili (0% e 13% rispettivamente con il mezzo K) nella condizione ST1, dell’81% da cotiledoni e del 53% da ipocotili (11% e 8% rispettivamente con il mezzo K) nella condizione ST2. Il numero di piante rigenerate sul mezzo GF è di 61 nella condizione ST1 e 91 nella condizione ST2, mentre solo 3 piante sono state rigenerate con successo sul mezzo K (condizione ST1). Delle 30 piante selezionate, 27 sono risultate positive all’integrazione del transgene. L’efficienza di editing è stata valutata mediante sequenziamento Sanger e analisi su TIDE. È stato possibile osservare il fenotipo bianco in sole due piante rigenerate. Il secondo approccio si basava su un protocollo innovativo che permette di ottenere l’induzione de novo di meristemi geneticamente modificati grazie all’uso di regolatori dello sviluppo inseriti nel costrutto di trasformazione. Le piante sono state interamente trasformate poco dopo la germinazione testando due combinazioni di regolatori dello sviluppo meristematico: WUSCHEL+SHOOT MERISTEMLESS e WUSCHEL+ISPOPENTENIL TRANSFERASI. Sono stati usati 3 diversi gRNA aventi come target il gene PDS. A partire dai cotiledoni si sono formate delle strutture callus-like, ma la rigenerazione di piante è avvenuta a partire dalle gemme. Delle 34 piante analizzate, 32 sono risultate positive all’integrazione del transgene, è stata dunque valutata l’efficienza di editing del sito target. I risultati della Tesi mostrano un eccellente tasso di rigenerazione di melanzana ma un’efficienza di editing limitata. S. melongena sembra, inoltre, essere poco sensibile all’espressione ectopica dei regolatori dello sviluppo, potrebbe dunque essere necessario sperimentare nuovi protocolli innovativi.
Nuove prospettive nello sviluppo di protocolli per la trasformazione e la rigenerazione di Solanum melongena L.
DE MARCHI, FEDERICA
2020/2021
Abstract
Il miglioramento genetico della melanzana (S. melongena L.) può essere finalizzato alla resistenza a stress abiotici e biotici o al miglioramento delle qualità dei frutti mediante la ricerca di alleli utili nei progenitori selvatici o mediante il breeding tradizionale, ma anche sfruttando la trasformazione genetica. Le tecnologie di genome editing sono risultate le più promettenti dal momento in cui offrono la possibilità di ottenere piante con caratteristiche desiderate in minor tempo inducendo mutazioni target. Il sistema di editing CRISPR/Cas è il più efficiente ed è stato applicato con successo solo una volta in melanzana, la cui rigenerazione in vitro dipende fortemente dal tipo di espianto e dal genotipo. Lo scopo di questa Tesi è di utilizzare due protocolli di genome editing, basati sulla trasformazione mediata da A. tumefaciens, per la trasformazione della cv. Black Beauty, utilizzando come target il gene PDS, scelto per il fenotipo bianco che può essere causato dalla sua inattivazione. Il primo approccio di trasformazione si basava su un protocollo di trasformazione stabile usando costrutti virali contenenti il gene Cas9 e un gRNA avente PDS come target. Sono state usate due concentrazioni di acetosyringone nella fase di co-coltura: 50 µM (condizione ST1) and 200 µM (condizione ST2). Sono stati usati due mezzi di rigenerazione: GF con ZN (zeatina riboside) e K con BAP (6-benzilamminopurina). Entrambi i mezzi contenevano GA3 (acido gibberellico) nella fase di elongazione, mentre i mezzi di radicazione contenevano IBA (acido 3-indol-butirrico). Il miglior tasso di rigenerazione è stato osservato con il mezzo GF in entrambe le condizioni di trasformazione (ST1, ST2): la percentuale di rigenerazione di germogli era del 44% da cotiledoni, 28% da ipocotili (0% e 13% rispettivamente con il mezzo K) nella condizione ST1, dell’81% da cotiledoni e del 53% da ipocotili (11% e 8% rispettivamente con il mezzo K) nella condizione ST2. Il numero di piante rigenerate sul mezzo GF è di 61 nella condizione ST1 e 91 nella condizione ST2, mentre solo 3 piante sono state rigenerate con successo sul mezzo K (condizione ST1). Delle 30 piante selezionate, 27 sono risultate positive all’integrazione del transgene. L’efficienza di editing è stata valutata mediante sequenziamento Sanger e analisi su TIDE. È stato possibile osservare il fenotipo bianco in sole due piante rigenerate. Il secondo approccio si basava su un protocollo innovativo che permette di ottenere l’induzione de novo di meristemi geneticamente modificati grazie all’uso di regolatori dello sviluppo inseriti nel costrutto di trasformazione. Le piante sono state interamente trasformate poco dopo la germinazione testando due combinazioni di regolatori dello sviluppo meristematico: WUSCHEL+SHOOT MERISTEMLESS e WUSCHEL+ISPOPENTENIL TRANSFERASI. Sono stati usati 3 diversi gRNA aventi come target il gene PDS. A partire dai cotiledoni si sono formate delle strutture callus-like, ma la rigenerazione di piante è avvenuta a partire dalle gemme. Delle 34 piante analizzate, 32 sono risultate positive all’integrazione del transgene, è stata dunque valutata l’efficienza di editing del sito target. I risultati della Tesi mostrano un eccellente tasso di rigenerazione di melanzana ma un’efficienza di editing limitata. S. melongena sembra, inoltre, essere poco sensibile all’espressione ectopica dei regolatori dello sviluppo, potrebbe dunque essere necessario sperimentare nuovi protocolli innovativi.| File | Dimensione | Formato | |
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