DESIGN E TEST DI INIBITORI INNOVATIVI DELLA BIOSINTESI DE NOVO DELLE PIRIMIDINE

De novo pyrimidine biosynthesis represents a ubiquitous metabolic process of central importance to obtain pyrimidine nucleotides, which build up nucleic acids and genetic material of cells. In mammalians, this biosynthetic way synergically acts with the salvage pathway, the process by which cells get pyrimidine nucleotides from the diet or from the recycle of pyrimidines. During a viral infection or cancer growth, proliferation processes inside the cell need a high pool of pyrimidines which requires de novo pathway activation. In pyrimidine starvation conditions, healthy host cells are able to satisfy anyway for some days the standard nucleotides requirement using salvage pathway. Therefore, in this therapeutic window, it is possible to identify enzymes in de novo pathway as potential targets for anticancer and broad-spectrum antiviral drugs. Today, several research lines are active on Acute Myeloid Leukemia (AML), with enzyme inhibitors in de novo pathway able to induce cellular differentiation and apoptosis. Recently, it seems possible to extend the action of these inhibitors on the replication of different viral models, such as SARS-CoV-2, responsible of current global pandemic. This Master Thesis describes the work done in the research of possible candidate drugs which act against enzymes of human de novo pathway. In particular, two consecutive enzymes have been identified as target in this biosynthetic pathway. The first identified enzyme is dihydroorotate dehydrogenase (DHODH), which catalyzes the conversion from dihydroorotate (DHO) to orotate (ORO). DHODH enzyme is a mitochondrial overt target in literature, for which several active inhibitors are known. Instead, the second target is represented by cytosolic bifunctional complex of uridine monophosphate synthase (UMPS), situated downstream of DHODH in de novo pathway. Definitely less known in literature, UMPS is made up by a transferase domain (orotate phosphoribosyltransferase or OPRTase) and by a lyase domain (orotidine 5’-monophosphate decarboxylase or ODCase), which catalyze respectively the synthesis of orotidine monophosphate (OMP) starting from ORO, and its next decarboxylation to uridine monophosphate (UMP). Within the hit-to-lead process of a drug, an efficient system of enzymatic tests of inhibitors is needed to identify activities and carry out proper optimization cycles of molecules. Thus, the entire system of enzymatic assay has been optimized for the hDHODH enzyme, in order to make the test more reproducible and faster. The improved enzymatic assay allowed to identify the SAR of 4th generation hDHODH inhibitors. Moving instead towards hUMPS enzyme, an in silico study has been directed to the identification of new potential scaffolds and active inhibitor modulations. Overall, the final goal of this work is obtaining a class of inhibitors that in future can synergically act in different points of de novo pyrimidine biosynthesis. Indeed, it is known in literature that multi-target therapies could represent a more efficient and long-term mode of action, especially in the cure of complex pathologies, also avoiding the development of collateral issues such as drug resistance.

La biosintesi de novo delle pirimidine rappresenta un processo metabolico ubiquitario di centrale importanza per ottenere i nucleotidi pirimidinici, che costituiscono gli acidi nucleici e il materiale genetico delle cellule. Questa via biosintetica nei mammiferi agisce in sinergia con la via salvage, il processo attraverso il quale le cellule ricavano i nucleotidi pirimidinici dalla dieta o dal riciclo delle pirimidine. Durante un’infezione virale o lo sviluppo di un tumore, i processi di proliferazione all’interno della cellula necessitano di un elevato pool di pirimidine, che richiede l’attivazione della via de novo. In condizioni di pyrimidine starvation, le cellule dell’ospite sane sono in grado per qualche giorno di soddisfare lo stesso il normale fabbisogno di nucleotidi sfruttando la via salvage. Di conseguenza, in questa finestra terapeutica, è possibile identificare gli enzimi nella via de novo come potenziali target per farmaci antitumorali e antivirali ad ampio spettro. Oggi sono attive diverse linee di ricerca su Leucemia Mieloide Acuta (LMA), con inibitori di enzimi nella via de novo in grado di indurre differenziazione e apoptosi cellulare. Recentemente sembra possibile estendere l’azione di questi inibitori sulla replicazione di diversi modelli virali, tra cui il SARS-CoV-2, responsabile della odierna pandemia globale. Questa Tesi di Laurea si occupa di descrivere il lavoro svolto nella ricerca di possibili candidati farmaci che agiscano sugli enzimi della via de novo umana. In particolare, quali target sono stati identificati due enzimi consecutivi in questa via biosintetica. Il primo enzima individuato è la diidroorotato deidrogenasi (DHODH), che catalizza la conversione da diidroorotato (DHO) a orotato (ORO). La DHODH è un target mitocondriale conclamato in letteratura, per cui sono noti numerosi inibitori attivi. Il secondo target è invece rappresentato dal complesso citosolico bifunzionale dell’uridina monofosfato sintasi (UMPS), situato a valle di DHODH nella via de novo. L’UMPS, decisamente meno nota in letteratura, è composto da un dominio transferasico (orotato fosforibosiltransferasi o OPRTasi) e da un dominio liasico (orotidina 5’-monofosfato decarbossilasi o ODCasi), che catalizzano rispettivamente la sintesi dell’orotidina monofosfato (OMP) a partire dall’ORO, e la sua successiva decarbossilazione a uridina monofosfato (UMP). All’interno del processo hit-to-lead di un farmaco è necessario avere un sistema efficace di test enzimatici degli inibitori, per identificare le attività ed eseguire degli adeguati cicli di ottimizzazione della molecola. Pertanto, per l’enzima hDHODH si è ottimizzato l’intero sistema di saggio enzimatico, in modo da rendere il test più riproducibile e rapido. Il saggio enzimatico ha quindi permesso di identificare la SAR di inibitori hDHODH di IV generazione. Muovendosi invece verso l’enzima hUMPS, uno studio in silico è stato diretto all’identificazione di nuovi potenziali scaffolds e modulazioni di inibitori attivi. Lo scopo finale di questo lavoro è quindi quello di ottenere nel futuro una classe di inibitori che possano agire sinergicamente in diversi punti della biosintesi de novo delle pirimidine. È infatti noto in letteratura come terapie multi-target possano rappresentare una modalità di azione più efficace a lungo termine, soprattutto nella cura di patologie complesse, evitando anche problemi collaterali, come lo sviluppo di una forma di resistenza al farmaco.