ALTERAZIONE DEL METABOLISMO DEL COLESTEROLO CEREBRALE NELLA MALATTIA DI HUNTINGTON: SVILUPPO DI UN METODO LC-MS PER LA DETERMINAZIONE DI PRECURSORI E METABOLITI DEL COLESTEROLO

La malattia di Huntington è un disturbo neurodegenerativo, causato dall’aumento delle ripetizioni CAG nel gene che codifica per la proteina huntingtina (HTT). Tale tripletta si traduce nell’amminoacido glutammina e l’aumento delle ripetizioni comporta la formazione di una proteina mutata con un’anormale catena di poliglutammine. L’HTT ricopre diverse funzioni all’interno dell’organismo, è in grado di legarsi ad alcuni recettori nucleari coinvolti nel metabolismo lipidico, influisce sull’espressione di alcuni enzimi coinvolti nella sintesi del colesterolo (Col) e sul rilascio del fattore neurotrofico cerebrale, anch’esso coinvolto nell’induzione della sintesi del Col. Diversi studi in letteratura evidenziano come la sintesi di HTT mutata porta alla degenerazione selettiva del corpo striato e ad una riduzione del metabolismo del Col cerebrale, testimoniato da una significativa riduzione dei livelli dei suoi precursori e metaboliti. Uno dei principali obiettivi della ricerca sulla malattia di Huntington è trovare un modo per ripristinare i livelli cerebrali di Col così da contrastare il declino cognitivo e motorio dovuto al progredire della malattia. La sfida analitica correlata è lo sviluppo di un metodo in LC-MS che sia in grado in un’unica corsa di misurare i livelli di precursori e metaboliti, nonostante la diversa polarità delle molecole, la presenza di numerosi isomeri e la loro diversa concentrazione a livello sia fisiologico che patologico. In questo lavoro di tesi si propone lo sviluppo di un metodo UHPLC-MRM per la misura di precursori e metaboliti del Col, dalla messa a punto del metodo di idrolisi ed estrazione all’ottimizzazione delle condizioni strumentali, cromatografiche e spettrometriche. Le condizioni strumentali sono state ottimizzate tramite infusione diretta degli standard, allo scopo di identificare transizioni specifiche per ogni analita ricercato. Il metodo cromatografico è stato ottimizzato per ottenere la miglior separazione cromatografica possibile per tutti i metaboliti analizzati e consiste in una corsa cromatografica in fase inversa, con un gradiente di acetato di ammonio 10 mM in acqua e in metanolo. Data la presenza in forma esterificata del Col e dei suoi metaboliti nei campioni biologici è stata ottimizzata una reazione di idrolisi alcalina valutando le performance della reazione in relazione alla concentrazione della base utilizzata, del tempo e della temperatura di incubazione. Le migliori performance sono state ottenute sottoponendo i campioni biologici ad una reazione di idrolisi in presenza di KOH 1M a 37°C per un’ora. Il metodo è stato testato in termini di robustezza, accuratezza e precisione intraday e interday e si è rivelato conforme alle linee guida per la validazione dei metodi bioanalitici con un’accuratezza e una precisione altamente riproducibili e sempre inferiori al 15%. L’analisi di campioni plasmatici umani per i livelli di ossisteroli ha dato dei risultati comparabili alla letteratura. L’analisi dei campioni cerebrali provenienti da animali modello della malattia ha evidenziato la presenza di livelli minori sia dei precursori che dei metaboliti del Col, confermando l’alterazione di questo pathway in presenza della malattia. In conclusione, il metodo presentato si è mostrato robusto e idoneo alla valutazione del pathway del Col cerebrale sia in tessuti cerebrali che plasmatici, potrà quindi essere utilizzato a livello clinico per il monitoraggio di pazienti.