Sindromi genetiche predisponenti al cancro nei sarcomi ossei pediatrici: incidenza e caratteristiche cliniche nel protocollo multicentrico SAR-GEN_ITA

Background: Ewing sarcomas and osteosarcomas are rare pediatric tumors with a poor prognosis, especially when metastatic or recurrent. The type, incidence, and impact of germline genetic alterations (Cancer Predisposition Syndromes - CPS) associated with these tumors are not fully understood due to the recent interest in genetic predisposition to pediatric cancers and the challenge of assembling large cohorts because of the rarity of these diseases. Objectives: This study aims to enhance the understanding of CPS associated with pediatric osteosarcomas and Ewing sarcomas by investigating the incidence and type of these alterations, along with the clinical characteristics of affected patients. Patients and Methods: The clinical protocol SAR-GEN_ITA allowed for the study of the tumor and germline genetic profiles of a cohort of 92 patients, affected by Ewing sarcoma (n = 40) or osteosarcoma (n = 52), through Whole Exome Sequencing (WES). This thesis focused on germline genetic alterations, detected in leukocytes isolated from the blood of each patient. For each sample, the sequences produced were aligned to the human genome (GRCh37/hg19) using Novoalign. An analysis of somatic and germline alterations followed, and only the latter (allelic frequency ≥ 25%), were considered for this thesis. The pathogenicity of these alterations was assessed through mutational databases (mainly https://franklin.genoox.com/clinical-db/home ). The alterations deemed "pathogenic" or "probably pathogenic" were analyzed for their structural and functional impact on the protein using https://alphafold.ebi.ac.uk and extensive literature research. Finally, the survival data of the cohort were analyzed using STATA v 17.0 and represented using Kaplan-Meier curves. Results: We identified a CPS in 17% of the patients in our cohort (6 patients with Ewing sarcoma and 10 patients with osteosarcoma). Specifically, in 1/6 cases of Ewing sarcoma and 8/10 cases of osteosarcoma, the analyses confirmed the presence of previously diagnosed alterations in the patients. In the remaining cases, 5 Ewing sarcomas and 2 osteosarcomas, WES identified previously undiagnosed genetic alterations. These new alterations, whose pathogenicity we assessed and confirmed, are associated with these tumors for the first time and involve: ERCC2, XPC, MUTYH, BRCA2, PALB2, UNC13D, SMARCAL1 and PRKN. The analysis of the cumulative clinical data of the cohort shows that germline genetic alterations constitute a negative prognostic index, likely predisposing to greater tumor aggressiveness and thus increased delayed mortality. Conclusions: The incidence and prognostic value of CPS in Ewing sarcomas and pediatric osteosarcomas highlight the need for early genetic counseling for these patients and their families, to enable a personalized care process and appropriate follow-up.

Background: I sarcomi di Ewing e gli osteosarcomi pediatrici sono tumori rari e gravati da prognosi ancora infausta, soprattutto se metastatici o recidivanti. La tipologia, l’incidenza e l’impatto delle alterazioni genetiche germinali (Cancer Predisposition Syndromes - CPS) associate a questi tumori sono note solo in parte, stanti l’interesse solo recente nei confronti della predisposizione genetica ai tumori pediatrici, e la difficoltà nel costituire coorti ampie a causa della rarità delle patologie. Obiettivi: Questo lavoro intende contribuire alla ricerca sulle CPS associate a osteosarcomi e sarcomi di Ewing pediatrici, attraverso lo studio dell’incidenza e della tipologia di queste alterazioni, nonché delle caratteristiche cliniche di questi pazienti. Pazienti e Metodi: Il protocollo clinico SAR-GEN_ITA ha permesso di studiare, attraverso Whole Exome Sequencing (WES), il profilo genetico tumorale e germinale di una coorte di 92 pazienti, affetti da sarcoma di Ewing (n = 40) od osteosarcoma (n = 52). Oggetto di questa tesi sono state le alterazioni genetiche germinali, rilevate nei leucociti isolati dal sangue di ciascun paziente. Per ogni campione, le sequenze prodotte sono state allineate al genoma umano (GRCh37/ hg19) utilizzando Novoalign. È seguita un’analisi delle alterazioni somatiche e germinali, tra cui solo quest’ultime (frequenza allelica ≥ 25%), sono state considerate ai fini di questa tesi. La patogenicità di queste alterazioni è stata vagliata attraverso database mutazionali (principalmente https://franklin.genoox.com/clinical-db/home ). Le alterazioni risultate “patogeniche” o “probabilmente patogeniche” sono state analizzate per il loro impatto strutturale e funzionale sulla proteina tramite https://alphafold.ebi.ac.uk e ampia ricerca bibliografica. Infine, i dati di sopravvivenza della coorte, sono stati analizzati tramite STATA v 17.0 e rappresentati tramite curve di Kaplan-Meier. Risultati: Abbiamo identificato una CPS nel 17% dei pazienti della nostra coorte (6 pazienti con sarcoma di Ewing e 10 pazienti con osteosarcoma). In particolare, in 1/6 casi di sarcoma di Ewing e 8/10 casi di osteosarcoma le analisi hanno confermato la presenza di alterazioni diagnosticate in precedenza nei pazienti. Nei restanti casi, 5 sarcomi di Ewing e 2 osteosarcomi, il WES ha identificato la presenza di alterazioni genetiche non diagnosticate in precedenza. Queste nuove alterazioni, di cui abbiamo vagliato e confermato la patogenicità, sono state qui per la prima volta associate a questi tumori e riguardano: ERCC2, XPC, MUTYH, BRCA2, PALB2, UNC13D, SMARCAL1 e PRKN. L’analisi dei dati clinici cumulativi della coorte mostra che le alterazioni genetiche germinali costituiscono un indice prognostico negativo, poiché verosimilmente predispongono a una maggiore aggressività tumorale e quindi a un’aumentata mortalità dilazionata nel tempo. Conclusioni: L’incidenza e il valore prognostico delle CPS nei sarcomi di Ewing e osteosarcomi pediatrici mettono in luce la necessità di effettuare sempre un counseling genetico precoce a questi pazienti e alle loro famiglie, in modo da poter mettere in atto un processo di cura personalizzato e un follow-up adeguato.