Attivazione della via Sirt1/Nrf2 da parte del 24-idrossicolesterolo come strategia per prevenire l'accumulo della proteina Tau nella malattia di Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease for which there is no cure yet. The characteristic lesions of AD are the extracellular β-amyloid plaques and the intraneuronal neurofibrillary tangles (NFT) formed by the hyperphosphorylated Tau protein. Among the various risk factors, hypercholesterolemia plays a fundamental role and oxysterols, oxidation products of cholesterol, represent the missing link between the altered metabolism of cholesterol in the brain and the pathogenesis of AD. This hypothesis is supported by numerous data in the literature which underline the involvement of oxysterols in the neurotoxicity process. One of the main oxysterols under study is 24-hydroxycholesterol (24-OHC), of enzymatic origin, for its dual action: neurotoxic or neuroprotective. In addition to its action promoting the pathogenesis of AD (Gamba et al., 2012), 24-OHC has recently gained interest in its potential protective action through the activation of neuroprotection pathways such as the SIRT1-dependent pathway (Testa et al., 2018). It has also been shown that 24-OHC increases the expression of SIRT1 through the production of reactive oxygen species and that SIRT1 is responsible of the subsequent activation, after deacetylation, of the peroxisome gamma proliferator coactivator 1 (PCG1-α ), an important factor involved in the processes of antioxidant defenses through the interaction with the nuclear transcription factor erythryoid-2 (Nrf2). The aim of this research was to investigate whether the treatment of human neuroblastoma cells SK-N-BE with 24-OHC (1μM) is able to directly modulate the SIRT1/Nrf2 axis by stimulating Tau ubiquitination, a modification that allows its subsequent degradation, thus preventing its phosphorylation and the formation of NFT and therefore the progression of the MA. An attempt was also made to understand whether this degradation occurs following the activation of the 26S proteasome. From the data obtained, it has been shown that 24-OHC is able to stimulate the ubiquitination of Tau by activating the SIRT1/Nfr2 axis. The involvement of SIRT1 in the activation of Nrf2 has been demonstrated by its silencing: by inhibiting SIRT1 there is an increase in the levels of acetylated Nrf2. The silencing of Nrf2, on the other hand, led to a reduction in the levels of ubiquitinated Tau, confirming that the ubiquitination process of the Tau protein depends on the activation of Nfr2. Assuming that ubiquitinated Tau can be degraded both by an autophagy process and by a proteasomal mechanism, we have tried to understand, using the MG132 proteasomal inhibitor (0.1μM), if ubiquitinated Tau is degraded by proteosome. From the data obtained it is clear that the treatment of cells with 24-OHC stimulates the ubiquitination and degradation of the Tau protein but that this degradation is not justifiable with the action of the proteasome alone, suggesting that other mechanisms can be activated by the oxysterol, such as autophagy. In conclusion, this research has confirmed that 24-OHC, at very low concentrations, has a neuroprotective action by stimulating the activity of the SIRT1 deacetylase which promotes the activation, through deacetylation, of Nrf2 with a consequent increase in ubiquitination and degradation of the Tau protein. . Activation of the neuroprotective pathway SIRT1/Nrf2 could be a new strategy to prevent the accumulation of hyperphosphorylated Tau and the consequent formation of NFT in AD.

La malattia di Alzheimer (MA) è una patologia neurodegenerativa per la quale non esiste ancora una cura. Le lesioni caratteristiche della MA sono le placche β-amiloidi extracellulari ed i grovigli neurofibrillari (GNF) intraneuronali formati dalla proteina Tau iperfosforilata. Tra i vari fattori di rischio l'ipercolesterolemia gioca un ruolo fondamentale e gli ossisteroli, prodotti di ossidazione del colesterolo, rappresentano l'anello mancante tra l'alterato metabolismo del colesterolo nel cervello e la patogenesi della MA. Questa ipotesi è supportata da numerosi dati in letteratura che sottolineano il coinvolgimento degli ossisteroli nel processo di neurotossicità. Uno dei principali ossisteroli oggetto di studio è il 24-idrossicolesterolo (24-OHC), di origine enzimatica, per la sua duplice azione: neurotossica o neuroprotettiva. Accanto alla sua azione promuovente la patogenesi della MA (Gamba e coll., 2012), ultimamente il 24-OHC ha riscosso interesse per una sua potenziale azione protettiva mediante l'attivazione di vie di neuroprotezione come la via SIRT1-dipendente (Testa e coll., 2018). È stato inoltre dimostrato che il 24-OHC iperesprime SIRT1 tramite la produzione delle specie reattive dell'ossigeno e che SIRT1 è responsabile della successiva attivazione, previa deacetilazione, del coattivatore 1 del proliferatore gamma del perossisoma (PCG1-α), un importante fattore coinvolto nei processi delle difese antiossidanti tramite l'interazione con il fattore trascrizionale nucleare eritrioide-2 (Nrf2). L'obiettivo di questa ricerca è stato quello di investigare se il trattamento delle cellule di neuroblastoma umano SK-N-BE con 24-OHC (1μM) sia in grado di modulare l'asse SIRT1/Nrf2 stimolando l'ubiquitinazione di Tau, una modificazione che ne permette la successiva degradazione, prevenendo così la sua fosforilazione e la formazione dei GNF e quindi la progressione della MA. Si è anche cercato di capire se tale degradazione avvenga in seguito all'attivazione del proteasoma 26S. Dai dati ottenuti si è dimostrato che il 24-OHC è in grado di stimolare l'ubiquitinazione di Tau tramite l'attivazione dell'asse SIRT1/Nfr2. Il coinvolgimento di SIRT1 nell'attivazione di Nrf2 è stato dimostrato mediante il suo silenziamento: inibendo SIRT1 si ha un aumento dei livelli di Nrf2 acetilata. Il silenziamento di Nrf2, invece, ha determinato una riduzione dei livelli di Tau ubiquitinata, confermando che il processo di ubiquitinazione della proteina Tau dipende dall'attivazione di Nfr2. Partendo dal presupposto che Tau ubiquitinata può essere degradata sia da un processo di autofagia che da un meccanismo proteasomico, abbiamo cercato di capire, utilizzando l'inibitore dell'attività proteasomica MG132 (0,1μM), se Tau ubiquitinata viene degradata per via proteosoma. Dai dati ottenuti è chiaro che il trattamento delle cellule con il 24-OHC stimola l'ubiquitinazione e la degradazione della proteina Tau ma che tale degradazione non è giustificabile con la sola azione delproteosoma lasciando supporre che altri meccanismi possano essere attivati dall'ossisterolo, come l'autofagia. In conclusione, questa ricerca ha confermato che il 24-OHC, a concentrazioni molto basse, ha un'azione neuroprotettiva stimolando l'attività della deacetilasi SIRT1 che promuove l'attivazione, tramite deacetilazione, di Nrf2 con conseguente aumento dell'ubiquitinazioe e degradazione della proteina Tau.