Editing del genoma mitocondriale e plastidiale tramite la deaminasi delle citosine DddAtox: il sistema DdCBE

Genetically modified (GM) plants are already used in several fields in many countries. One new promising approach for the production of GM plants is the modification of the genetic material inside plastids (ptDNA) and mitochondria (mtDNA). DNA alteration of these organelles has several advantages compared to nuclear DNA alteration, including higher levels of transgene transcription, as well as the synthesis of the related protein, lack of gene silencing phenomena and absence of transgene spreading in the environment, due to the maternal inheritance of organelles in the majority of plants, solving one of the main critiques moved to GM plants. This technology is still rarely used due to current limitations affecting the stable introduction of the transgene. The main protocols for nuclear DNA transformation, which are Agrobacterium tumefaciens protocol or Polyethylene glycol mediated transformation, are not fully viable for ptDNA and mtDNA transformation. Similar problems exist for genetic editing preventing specific modifications in targeted sequences of ptDNA or mtDNA. In this paper the DdCBE (DddA-derived cytosine base editor) system is proposed as a new tool for ptDNA and mtDNA editing. The system is based on the bacterial toxin DddAtox (Double-stranded DNA deaminase Toxin A), which is able to convert cytosine into uracil, in 5’-TC contexts, which is then used as a template during DNA replication, leading to a C-G to T-A conversion. Targeting of the system is controlled by TAL effectors, ensuring high precision and efficiency. It is also examined a recent study describing the modification of the RNA 16S gene of ptDNA in lettuce (Lactuca sativa), which led to acquisition of stable resistance to streptomycin, subsequently exploited for the selection of engineered cells. For the purpose of increasing the efficacy of DdCBE editing protocol, carbon nanotubes complexed with chitosan are proposed as the method for the selective transfection of DNA in these organelles, based on a recent use in chloroplasts. The features of these nanoparticles allow the penetration of cell membrane and plastid/mitochondrial double membrane, followed by the release, only in a slightly basic environment, of the genetic material, which is carried thanks to electrostatic interactions between the nanoparticle complex and the DNA molecules occurring at acidic pH. The transient transfection performed by this method is optimal for introducing an editing system, since the system is synthesized and lasts only for the needed time, avoiding non-specific mutation events at a later time.

Le piante geneticamente modificate (GM) sono già impiegate in diversi settori in molti paesi del mondo. Una delle tecnologie più promettenti per la generazione di piante GM è la trasformazione del materiale genetico presente nei plastidi (ptDNA) e nei mitocondri (mtDNA). La modifica del DNA di questi organuli presenta numerosi vantaggi rispetto alla trasformazione del genoma nucleare, tra cui un livello più alto di trascrizione del transgene, e quindi di produzione della relativa proteina, l’assenza di fenomeni di gene silencing e la mancata dispersione del transgene nell’ambiente, dato che nella maggior parte delle piante gli organelli vengono ereditati per via materna, risolvendo così una delle principali critiche mosse alle piante GM. Questo approccio è però poco sfruttato a causa degli attuali limiti tecnici nell’introduzione stabile del transgene. I protocolli maggiormente utilizzati per la trasformazione del DNA nucleare, tra cui la trasformazione mediante Agrobacterium tumefaciens o polietilenglicole, non sono infatti applicabili efficacemente al ptDNA e mtDNA. Limiti simili sono presenti per l’editing genomico, impedendo modifiche mirate in siti specifici del DNA di questi organuli. In questo lavoro si presenta il sistema DdCBE (DddA-derived cytosine base editor) come nuovo strumento per l’editing del ptDNA e mtDNA. Il sistema basa la sua attività sulla tossina batterica DddAtox (Double-stranded DNA deaminase Toxin A) in grado di convertire la citosina in uracile, in contesti 5’-TC, il quale viene poi utilizzato come stampo durante la replicazione del DNA, causando una conversione C-G in T-A. L’indirizzamento del complesso verso il sito bersaglio è ad opera di effettori TAL, garantendo un’elevata precisione ed efficienza. Si prende in esame soprattutto il risultato di un recente studio dove è stato modificato con successo il gene per l’RNA 16S del DNA plastidiale di lattuga (Lactuca sativa), conferendo resistenza permanente alla streptomicina, sfruttata in un secondo momento come metodo di selezione delle cellule trasformate. Inoltre, allo scopo di aumentare l’efficacia del protocollo di editing tramite DdCBE, si propone l’utilizzo di nanotubi di carbonio complessati con chitosano come metodo di trasfezione selettivo per questi organuli, sulla base di una recente applicazione in plastidi. Le caratteristiche di queste nanoparticelle permettono la penetrazione spontanea della membrana cellulare e della doppia membrana plastidiale/mitocondriale, seguito dal rilascio del materiale genetico contenuto solo in ambiente leggermente basico, a causa di fenomeni di interazione elettrostatiche tra complesso e molecole di DNA che si verificano a pH acido. La trasfezione transiente che ne consegue è ideale per l’introduzione di un complesso di editing, siccome il complesso viene prodotto e permane solo per il tempo necessario per l’espletamento delle sue funzioni, evitando il verificarsi di eventi di mutazione aspecifici in un secondo momento.