Antiretroviral drugs represent the only option to maintain viral suppression for a long time and consequently reduce morbidity and mortality related to AIDS in HIV + patients. Since 1996 there has been a gradual improvement in the treatment of HIV infection with the introduction of combined therapies called ¿Highly Active Antiretroviral Therapy¿ (HAART), which consists in the co-administration of drugs belonging to different classes. The Therapeutic Drug Monitoring (TDM), is a practice widely used by clinicians to support the adjustment or the change of current therapies, in order to prevent the therapeutic failure and / or drug toxicity. The TDM needs, however, specialized and qualified laboratories. The fact that there are not many of them, makes the analysis necessarily dependent, through the shipment of samples, to few elite centers able to perform it, limiting thus the application of TDM. The spread of TDM can be encouraged by reducing costs and shipping time of the samples, using innovative applications such as Dried Sample Spots Device (DSSD) based on dried plasma spots (DPS) and dried blood spots (DBS). The aim of this thesis has been to validate alternative drug's dosage methods using the DSSD for the quantification of 12 antiretroviral drugs, (all thermostable drugs) on DPS and DBS, analyzed with different chromatographic systems, and secondly, to compare methods (HPLC vs. UPLC PDA vs MS / MS) and matrices (DPS vs DBS vs Plasma) using real samples and only the most frequently administered drugs. To this aim, we analyzed plasma samples of 40 HIV-positive patients treated with NNRTIs (Nevirapina, Efavirenz) and PIs (AtazanavirRitonavir, Raltegravir, Darunavir, Lopinavir) afferent to ¿Amedeo di Savoia¿ Hospital in Turin. At least 10 samples for each drug tested, with the DPS and DBS, were analyzed with two validated instrumental methods: HPLC-PDA and UPLC-MS/MS. The results obtained with the DPS and DBS were compared to the plasma assay (gold standard) performed using a previously validated and published method. Methods that required the use of DPS and DBS, analyzed with HPLC-PDA and UPLC-MS/MS, were validated. These methods resulted solid, precise and accurate in accordance with FDA's guidelines. The comparison between matrices (DPS vs DBS) showed that antiretroviral drugs with DPS could be analyzed using both methods for analysis , instead of plasma samples analyzed with the reference method. For some drugs such as Raltegravir, Atazanavir and Nevirapine the results show the possibility to use the DBS also, although the values of DS% were border-line. It appears evident, however, from a pure comparison between plasma and blood on DSSD, that the best biological material to get a more accurate and precise results, remains absolutely the plasma. In conclusion, when it is necessary, the DPS can be used, as an alternative, instead of plasma samples, with both analysis on HPLC-PDA (better) and on UPLC-MS/MS. The DPS, in fact, offers a huge advantage bringing a reduction in shipping costs, providing easy storage and shipping even at room temperature, making, thus, the TDM accessible to more centers.
I farmaci antiretrovirali rappresentano la sola opzione per mantenere a lungo la soppressione virale e ridurre conseguentemente la morbilità e la mortalità correlate all'AIDS, nei pazienti HIV+. A partire dal 1996 c'è stato un progressivo miglioramento nel trattamento dell'infezione da HIV, grazie all'introduzione delle terapie di combinazione definite Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART), che consistono nella co-somministrazione di farmaci appartenenti a classi diverse. Il Theraputic Drug Monitoring (TDM), è una pratica largamente impiegata dai clinici come supporto per l'aggiustamento o il cambio della terapia in corso, per prevenire il fallimento terapeutico e/o la tossicità da farmaco. Il TDM necessità però di laboratori specializzati e qualificati. La scarsità di questi laboratori rende l'analisi necessariamente subordinata, attraverso la spedizione dei campioni, ai pochi centri di elite in grado di effettuarla, limitando di fatto l'impiego del TDM. La diffusione del TDM può essere favorita dall'abbattimento dei costi e dei tempi di spedizione del campione, utilizzando dei sistemi innovativi come i Dried Sample Spots Device (DSSD) basato sui dried plasma spots (DPS) e sui dried blood spots (DBS). Lo scopo di questa tesi è stato quello di validare dei metodi alternativi di dosaggio con i DSSD per la quantificazione di 12 farmaci antiretrovirali (tutti farmaci termostabili) su DPS e DBS su diversi sistemi cromatografici, e in seconda battuta, effettuare un confronto tra metodiche (HPLC vs UPLC, PDA vs MS/MS)e matrici (DPS vs DBS vs Plasma) su campioni reali e solo sui farmaci più frequentemente somministrati. Per fare ciò sono stati analizzati i campioni plasmatici di 40 pazienti sieropositivi in terapia con NNRTIs (Nevirapina, Efavirenz) e PIs (Atazanavir, Ritonavir, Raltegravir, Darunavir, Lopinavir)afferenti all'Ospedale Amedeo di Savoia di Torino. Non meno di 10 campioni per ogni farmaco testato, con i DPS e DBS sono stati analizzati con due metodi strumentali validati: HPLC-PDA e UPLC-MS/MS. I risultati ottenuti con i DPS e DBS sono stati confrontati con il dosaggio plasmatico (gold standard) con un metodo precedentemente validato e pubblicato. I metodi che prevedevano l'utilizzo dei DPS e dei DBS analizzati con la tecnica UPLC-MS/MS e HPLC-PDA sono stati validati. I metodi sono risultati robusti, precisi ed accurati in accordo con le linee guida FDA. Dal confronto delle matrici (DPS vs DBS) è emerso che i DPS, analizzati con entrambi i metodi, possono essere considerati due metodi fruibili per le analisi degli antiretrovirali oggetto di studio, anche al posto dei campioni plasmatici analizzati con la metodica di riferimento. Per alcuni farmaci come il Raltegravir, l'Atazanavir e la Nevirapina i risultati mostrano la possibilità di utilizzare anche i DBS, seppure con dei valori di DS% border-line. Risulta però evidente, da un puro confronto tra plasma e sangue sui DSSD, che il materiale biologico d'elezione per avere risultati più accurati e precisi rimane assolutamente il plasma. In conclusione, è possibile dunque utilizzare come alternativa del campione plasmatico, laddove necessario, i DPS, con analisi sia su HPLC-PDA (meglio) che UPLC-MS/MS. I DPS infatti offrono un'enorme vantaggio portando una riduzione dei costi di spedizione, garantendo una facile conservazione e spedizione anche a temperatura ambiente rendendo così di fatto il TDM accessibile a più centri.
L'uso dei Dried Plasma Spots su DSSD e confronto fra metodi nella pratica clinica del Therapeutic Drug Monitoring degli antiretrovirali.
GHO, ELENA
2011/2012
Abstract
I farmaci antiretrovirali rappresentano la sola opzione per mantenere a lungo la soppressione virale e ridurre conseguentemente la morbilità e la mortalità correlate all'AIDS, nei pazienti HIV+. A partire dal 1996 c'è stato un progressivo miglioramento nel trattamento dell'infezione da HIV, grazie all'introduzione delle terapie di combinazione definite Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART), che consistono nella co-somministrazione di farmaci appartenenti a classi diverse. Il Theraputic Drug Monitoring (TDM), è una pratica largamente impiegata dai clinici come supporto per l'aggiustamento o il cambio della terapia in corso, per prevenire il fallimento terapeutico e/o la tossicità da farmaco. Il TDM necessità però di laboratori specializzati e qualificati. La scarsità di questi laboratori rende l'analisi necessariamente subordinata, attraverso la spedizione dei campioni, ai pochi centri di elite in grado di effettuarla, limitando di fatto l'impiego del TDM. La diffusione del TDM può essere favorita dall'abbattimento dei costi e dei tempi di spedizione del campione, utilizzando dei sistemi innovativi come i Dried Sample Spots Device (DSSD) basato sui dried plasma spots (DPS) e sui dried blood spots (DBS). Lo scopo di questa tesi è stato quello di validare dei metodi alternativi di dosaggio con i DSSD per la quantificazione di 12 farmaci antiretrovirali (tutti farmaci termostabili) su DPS e DBS su diversi sistemi cromatografici, e in seconda battuta, effettuare un confronto tra metodiche (HPLC vs UPLC, PDA vs MS/MS)e matrici (DPS vs DBS vs Plasma) su campioni reali e solo sui farmaci più frequentemente somministrati. Per fare ciò sono stati analizzati i campioni plasmatici di 40 pazienti sieropositivi in terapia con NNRTIs (Nevirapina, Efavirenz) e PIs (Atazanavir, Ritonavir, Raltegravir, Darunavir, Lopinavir)afferenti all'Ospedale Amedeo di Savoia di Torino. Non meno di 10 campioni per ogni farmaco testato, con i DPS e DBS sono stati analizzati con due metodi strumentali validati: HPLC-PDA e UPLC-MS/MS. I risultati ottenuti con i DPS e DBS sono stati confrontati con il dosaggio plasmatico (gold standard) con un metodo precedentemente validato e pubblicato. I metodi che prevedevano l'utilizzo dei DPS e dei DBS analizzati con la tecnica UPLC-MS/MS e HPLC-PDA sono stati validati. I metodi sono risultati robusti, precisi ed accurati in accordo con le linee guida FDA. Dal confronto delle matrici (DPS vs DBS) è emerso che i DPS, analizzati con entrambi i metodi, possono essere considerati due metodi fruibili per le analisi degli antiretrovirali oggetto di studio, anche al posto dei campioni plasmatici analizzati con la metodica di riferimento. Per alcuni farmaci come il Raltegravir, l'Atazanavir e la Nevirapina i risultati mostrano la possibilità di utilizzare anche i DBS, seppure con dei valori di DS% border-line. Risulta però evidente, da un puro confronto tra plasma e sangue sui DSSD, che il materiale biologico d'elezione per avere risultati più accurati e precisi rimane assolutamente il plasma. In conclusione, è possibile dunque utilizzare come alternativa del campione plasmatico, laddove necessario, i DPS, con analisi sia su HPLC-PDA (meglio) che UPLC-MS/MS. I DPS infatti offrono un'enorme vantaggio portando una riduzione dei costi di spedizione, garantendo una facile conservazione e spedizione anche a temperatura ambiente rendendo così di fatto il TDM accessibile a più centri.| File | Dimensione | Formato | |
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