Studio in vitro dell'efficacia antitumorale del trattamento sonodinamico mediante onde d'urto ad alta energia ed acido-5-aminolevulinico

One of the most important aims in cancer therapy is to develop an effective therapy against the tumor avoiding the adverse reactions. To do so many researchers have introduced, in this field, the photodynamic therapy (PDT) where nontoxic light-sensitive compounds (photosensitizers) are able to kill cancer cells after the irradiation by a light source. However this promising approach shows some disadvantages, mainly due to the poor penetration of light in biological tissues, for this reason PDT is usually used to treat tumors on or just under the skin or on the lining of internal organs or cavities. Therefore, in order to overcome this drawback, a new treatment, called sonodynamic therapy (SDT), has been suggested. Sonodynamic therapy (SDT) is a newly developed anticancer treatment where ultrasound is used to trigger the cytotoxic effect of chemical compounds, known as sonosensitizers. Although SDT is similar to PDT, SDT activates the chemical compounds through energy transfer using ultrasound rather than light. Moreover, SDT can focus the ultrasound energy onto malignant sites situated deeply within tissues, thus overcoming the main drawback linked to the use of PDT. Several physical and chemical mechanisms underlying ultrasound bioeffects and anticancer SDT take advantage of the non-thermal effect of acoustic cavitation generated by selected pulsed as High Energy Shock Wave (HESW) or continuous ultrasound. The aim of this project is to investigate, by cell growth curves, cell death evaluation and gene expression analysis, the effects produced by PDT and SDT (HESW) on a human melanoma line A2058 and a human fibrosarcoma line HT-1080, treated with 5-aminolevulinic acid (Ala). In A2058 cells a decrease in cell growth was observed in cells treated with Ala after both treatments, even if SDT produces a gradual decrease all over the time, in which the results are more evident at 72 h; this is confirmed by cell death evaluation which highlights a percentage increase of apoptotic cells in the treated ones. After the treatment, the gene analysis has shown an over-expression of bax, a pro-apoptotic gene, sod2 and nqo1, genes involved in the stress oxidative process. In HT-1080 the SDT is more effective in cell growth reduction than PDT. After the treatments the gene expression has shown a significant over-expression of apaf1, a pro-apoptotic gene (p<0.001). In conclusion, this study has shown that both cell lines (A2058 and HT-1080) are sensitive either to PDT or SDT even though the SDT treatment seems more effective in the fibrosarcoma cell line.

Uno degli obiettivi principali che sia ricercatori che oncologi si prefiggono è quello di sviluppare una terapia che abbia minimi effetti tossici collaterali con lo scopo di aumentare la sopravvivenza nei pazienti neoplastici. La terapia fotodinamica (PDT) è un trattamento terapeutico che consiste nella foto-irradiazione di un foto-sensibilizzante attraverso una sorgente luminosa, avendo come risultato la generazione di radicali liberi, in particolare specie reattive dell'ossigeno (ROS). Lo svantaggio che presenta la PDT è dato dalla bassa penetrazione della luce nei tessuti interessati a causa delle lunghezze d'onda utilizzate (380-780 nm). Per sopperire a questa limitazione si sta sviluppando un nuovo trattamento: la terapia sonodinamica (SDT). La SDT correla l'effetto cavitazionale o non-termico degli ultrasuoni attraverso l'utilizzo di una nuova forma di energia, le onde d'urto ad alta energia (HESW), con una molecola simile ai foto-sensibilizzanti, detta sono-sensibilizzante. La cavitazione provoca la produzione di sonoluminescenza, cioè la presenza di un'energia sufficiente ad emettere luce, che può essere in grado di attivare il sono-sensibilizzante. Questo fenomeno comporta la formazione di ROS e la conseguente induzione di apoptosi. Nella PDT e SDT una delle molecole più utilizzate, biologicamente inattiva e non tossica, è l'acido-5-aminolevulinico (Ala), un pro-farmaco che, entrando nelle cellule, viene trasformato in protoporfirina IX (PPIX), tramite la via endogena di biosintesi dell'eme. In questo studio in vitro si sono analizzati gli effetti indotti dalla PDT e dalla SDT su una linea di melanoma umano A2058 ed una linea di fibrosarcoma umano HT-1080, trattate con Ala, attraverso curve di crescita cellulare, valutazione della morte cellulare e analisi dell'espressione genica. I risultati ottenuti per le A2058 hanno dimostrato una riduzione della crescita cellulare nelle cellule trattate in presenza di Ala dopo entrambi i trattamenti, sebbene la SDT produca un effetto più graduale nel tempo, in cui i risultati sono più evidenti a 72 h; ciò è confermato dal test dell'apoptosi che evidenzia un incremento percentuale delle cellule trattate. L'espressione genica condotta dopo i trattamenti ha portato ad una iper-espressione dei geni pro-apoptotici (bax) e nei geni coinvolti nel meccanismo dello stress ossidativo (sod2, nqo1). Nelle HT-1080 il trattamento SDT si è dimostrato più efficace nel processo di riduzione della crescita cellulare, rispetto a quello della PDT. L'analisi dell'espressione genica indica come nelle cellule dopo trattamento con PDT e SDT si abbia un'iper-regolazione significativa di apaf1 (p<0.001). In conclusione, le A2058 e le HT-1080 risultano essere sensibili a trattamenti di tipo fotodinamico e sonodinamico; è possibile inoltre evidenziare come la SDT con Ala 0.45 mM ed HESW sia in grado di determinare una significativa riduzione della crescita cellulare in modo più efficace nella linea cellulare di melanoma rispetto alla linea cellulare di fibrosarcoma.