Abiotic stresses, such as drought and salt stress, represent the main cause for crop losses worldwide. Plant responses to environmental stresses, and their subsequent adaptation, are driven by a complex series of physiological and molecular events, among which mechanisms of gene regulation represent one of the most important and studied phenomena. Small RNAs (sRNAs), in particular microRNAs (miRNAs), are crucial regulators of developmental and physiological processes in plants, but they also play a key role in regulating genes involved in responses to abiotic stresses. In this study, four conserved miRNAs (miR156, miR159, miR393, miR396) and a miRNA specific of grapevine (miR3624) were analyzed in leaf and root tissues of Cabernet Sauvignon (CS) and M4 rootstock grapevine genotypes under water stress. Moreover, the same miRNAs were studied under salt stress conditions in M4 and 101.14 grapevine rootstocks. Physiological parameters were daily measured on droughted and irrigated plants, in order to assess the maximum level of stress optimal for sampling (gs < 0.05 mmol H2O m-2 s-1 and Ψleaf ~ -1.4 MPa). Low Molecular Weight RNA (LMW RNA) was extracted from root and leaf samples, collected during the physiological experiments, and used to prepare cDNA libraries, which were processed by means of SOLiD platform and were also used for carrying out q-PCR analysis. Expression data revealed that the five miRNAs considered are involved in response to drought and salt stresses. Nevertheless, some expression differences, dependent on the treatment, genotype and tissue analyzed, were observed. More in detail, upon drought stress, miR156, miR159, miR393, miR396 were exclusively over-expressed in roots of both genotypes analyzed; on the contrary, miR3624 appeared down-regulated in all tissues and genotypes. In condition of salt stress, diverse expression profiles were observed for all miRNAs considered, since these regulatory sequences exhibited a specific expression strictly depending on the tissue and genotype analyzed. Further qRT-PCR analyses were performed, in order to investigate expression patterns of some target genes, which are typically post-transcriptionally regulated by the miRNAs studied. The observation of opposite expression profiles for each microRNA and its target allowed to confirm, in the majority of the cases, that miRNAs actually target their related genes. In particular, these miRNAs act on genes encoding for transcription factors or proteins involved in specific intracellular cascades; hence, they do not exert their action on genes directly involved in mechanism of stress resistance. In conclusion, the five miRNAs studied seem to play a key role in the regulation of growth and developmental processes in response to abiotic stresses. On the basis of these considerations, miRNA regulations could represent the molecular basis for future genetic breeding programs aimed at improving the resistance of crop species to abiotic stresses.
Gli stress abiotici da sempre costituiscono la causa principale delle perdite di raccolto. L'influenza che l'ambiente esercita sullo sviluppo e la crescita delle piante tenderà ad emergere sempre più palesemente, poiché in futuro si assisterà ad un ulteriore inasprimento delle condizioni ambientali. E' necessario, pertanto, approfondire i meccanismi molecolari e fisiologici che le piante attuano quando si trovano a fronteggiare condizioni ambientali avverse. Lo studio dei piccoli RNA, ed in particolare dei microRNA (miRNA), risulta infatti strategico sia alla luce delle recenti scoperte che assegnano a tali molecole un ruolo fondamentale nei meccanismi di regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica, sia perché queste sequenze sembrano essere direttamente coinvolte nelle risposte agli stress di varia natura, tra cui gli stress abiotici. Questo lavoro di tesi ha come scopo lo studio di quattro miRNA conservati (miR156, miR159, miR393, miR396) e un microRNA specifico di vite (miR3624), in diversi genotipi del genere Vitis sottoposti a due tipologie di stress abiotici. In particolare, la cv C.Sauvignon e il portinnesto M4 sono stati sottoposti a stress idrico, mentre i portinnesti M4 e 101.14 sono stati sottoposti a trattamento di stress salino. Una serie di misure fisiologiche é stata effettuata ogni giorno durante il trattamento, al fine di individuare il picco massimo di deficit idrico (gs < 0.05 mol H2O m-2 s-1 and Ψleaf ~ -1.4 MPa), necessario per il campionamento. L'RNA a basso peso molecolare (LMW RNA) è stato estratto da campioni di radici e foglie prelevate dalle viti sottoposte a stress e dai relativi controlli irrigati ed è stato utilizzato per condurre un'analisi di sequenziamento e in parallelo un'analisi di espressione mediante Real-time PCR (qRT-PCR). I dati di espressione indicano che i cinque miRNA considerati sono coinvolti nelle risposte allo stress idrico e salino; tuttavia, sono state riscontrate differenze dipendenti non soltanto dal trattamento imposto, ma anche dal genotipo e dal tessuto analizzato. Più in dettaglio, miR156, miR159, miR393, miR396 sono sovra-espressi nelle radici di C. Sauvignon ed M4 sottoposti a stress idrico, mentre miR3624 risulta sotto-espresso in entrambi i tessuti e genotipi. Nei genotipi M4 e 101.14 testati in condizioni di stress salino non è stato possibile delineare un quadro chiaro riguardo l'espressione dei miRNA oggetto di studio, a testimonianza del fatto che, a seconda della condizione di stress imposta, queste sequenze regolatrici possano rispondere, oltre che in modo tessuto-specifico, anche in dipendenza del particolare genotipo. Inoltre, sono state condotte analisi di espressione mediante qRT-PCR su alcuni geni bersaglio dei miRNA studiati, che hanno permesso di confermare, nella maggior parte dei casi, come questi geni vengano regolati post-trascrizionalmente dai miRNA ad essi legati. In particolare, questi miRNA agiscono su fattori di trascrizione o proteine coinvolti nella trasduzione di specifici segnali; non si tratta, quindi, di geni direttamente implicati nei meccanismi di resistenza allo stress, ma di trascritti che regolano lo sviluppo vegetativo e riproduttivo della pianta. Alla luce di queste considerazioni, lo studio dei miRNA potrebbe costituire in futuro un valido supporto per programmi di miglioramento genetico finalizzati ad incrementare la resistenza delle specie coltivate nei confronti degli stress abiotici.
Piccoli RNA coinvolti nella risposta agli stress abiotici in vite
LOGRECO, ELEONORA
2011/2012
Abstract
Gli stress abiotici da sempre costituiscono la causa principale delle perdite di raccolto. L'influenza che l'ambiente esercita sullo sviluppo e la crescita delle piante tenderà ad emergere sempre più palesemente, poiché in futuro si assisterà ad un ulteriore inasprimento delle condizioni ambientali. E' necessario, pertanto, approfondire i meccanismi molecolari e fisiologici che le piante attuano quando si trovano a fronteggiare condizioni ambientali avverse. Lo studio dei piccoli RNA, ed in particolare dei microRNA (miRNA), risulta infatti strategico sia alla luce delle recenti scoperte che assegnano a tali molecole un ruolo fondamentale nei meccanismi di regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica, sia perché queste sequenze sembrano essere direttamente coinvolte nelle risposte agli stress di varia natura, tra cui gli stress abiotici. Questo lavoro di tesi ha come scopo lo studio di quattro miRNA conservati (miR156, miR159, miR393, miR396) e un microRNA specifico di vite (miR3624), in diversi genotipi del genere Vitis sottoposti a due tipologie di stress abiotici. In particolare, la cv C.Sauvignon e il portinnesto M4 sono stati sottoposti a stress idrico, mentre i portinnesti M4 e 101.14 sono stati sottoposti a trattamento di stress salino. Una serie di misure fisiologiche é stata effettuata ogni giorno durante il trattamento, al fine di individuare il picco massimo di deficit idrico (gs < 0.05 mol H2O m-2 s-1 and Ψleaf ~ -1.4 MPa), necessario per il campionamento. L'RNA a basso peso molecolare (LMW RNA) è stato estratto da campioni di radici e foglie prelevate dalle viti sottoposte a stress e dai relativi controlli irrigati ed è stato utilizzato per condurre un'analisi di sequenziamento e in parallelo un'analisi di espressione mediante Real-time PCR (qRT-PCR). I dati di espressione indicano che i cinque miRNA considerati sono coinvolti nelle risposte allo stress idrico e salino; tuttavia, sono state riscontrate differenze dipendenti non soltanto dal trattamento imposto, ma anche dal genotipo e dal tessuto analizzato. Più in dettaglio, miR156, miR159, miR393, miR396 sono sovra-espressi nelle radici di C. Sauvignon ed M4 sottoposti a stress idrico, mentre miR3624 risulta sotto-espresso in entrambi i tessuti e genotipi. Nei genotipi M4 e 101.14 testati in condizioni di stress salino non è stato possibile delineare un quadro chiaro riguardo l'espressione dei miRNA oggetto di studio, a testimonianza del fatto che, a seconda della condizione di stress imposta, queste sequenze regolatrici possano rispondere, oltre che in modo tessuto-specifico, anche in dipendenza del particolare genotipo. Inoltre, sono state condotte analisi di espressione mediante qRT-PCR su alcuni geni bersaglio dei miRNA studiati, che hanno permesso di confermare, nella maggior parte dei casi, come questi geni vengano regolati post-trascrizionalmente dai miRNA ad essi legati. In particolare, questi miRNA agiscono su fattori di trascrizione o proteine coinvolti nella trasduzione di specifici segnali; non si tratta, quindi, di geni direttamente implicati nei meccanismi di resistenza allo stress, ma di trascritti che regolano lo sviluppo vegetativo e riproduttivo della pianta. Alla luce di queste considerazioni, lo studio dei miRNA potrebbe costituire in futuro un valido supporto per programmi di miglioramento genetico finalizzati ad incrementare la resistenza delle specie coltivate nei confronti degli stress abiotici.| File | Dimensione | Formato | |
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