Studio di derivati della doxorubicina in grado di rilasciare NO per via fotochimica

Doxorubicin (DOXO) is an antineoplastic antibiotic belonging to the anthracycline family, one of the most used anti-cancer drugs. In recent years, nitric oxide (NO) has stimulated an explosion of interest not only due to its pivotal role in the maintenance and bioregulation of vital functions, but also for its promising anticancer activity. NO radical is able to attack biological substrates of different nature like the plasma membrane, the mitochondria and the cell nucleus, representing a multitarget cytotoxic agent, which does not suffer MDR problems encountered with target-specific ¿conventional¿ anticancer drugs. For the use of NO in anticancer strategy the concentration, the location and the dose are very important. Many classes of NO donors have been developed in recent years, however, they suffer important limitations since they are cleared rapidly in the body, they release NO with limited control and need to be tailored to reach the specific target. Light represents a powerful and minimally invasive trigger for the release of NO in biological systems with spatiotemporal accuracy by using suitable NO photodonors (NOPD). These compounds allow to confine the site of action of NO at the illuminated area with high spatial precision and to control its dosage with great accuracy by tuning the light intensity and/or duration. My thesis work has focused at first on the characterization of various NOPD for their NO-release properties and subsequently on the study of DOXO-NODP hybrids. These compounds were evaluated in terms of chemical and metabolic stability and in term of NO-release properties. In particular the compounds were characterized by a RP-HPLC method, with regard to their stability in physiological solution, in medium used for the tumor cells chosen for the preliminary tests in vitro, as well as in human serum, in order to obtain preliminary indications about their pharmacokinetic behavior for a prediction of behavior in cellular assays. In parallel, they were made of the NO-release tests under photostimulation to verify that they maintained the photochemical properties of NOPD. Subsequently, thanks to the collaboration of Prof. Chiara Riganti of the Department of Oncology, the structures have been subjected to in vitro tests on cancer cells MCF7 (breast carcinoma line, doxorubicin-sensitive, negative for the majority of membrane transporters) and M14 (melanoma cells), in order to assess the ability of overcoming the MDR efflux pumps for the block, compared to doxorubicin.

La doxorubicina (DOXO) è un antibiotico antineoplastico, utilizzato in una grande varietà di tumori, tuttavia il suo uso in terapia è limitato dall'insorgenza della chemioresistenza; essa è soggetta all'azione di trasportatori di membrana (Pgp e MRPs), espressi a livello delle cellule così dette ¿resistenti¿, che ne riducono l'accumulo e quindi la citotossicità. L'ossido nitrico (NO) è in grado di interagire con substrati biologici di varia natura (membrana plasmatica, mitocondri e nucleo della cellula) e rappresenta un agente citotossico multitarget, che non soffre dei problemi di chemioresistenza. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che l'NO è efficace nel bloccare le pompe di efflusso, migliorando accumulo e tossicità di DOXO nelle cellule resistenti.(1) Il lavoro di questa tesi si inserisce in un nuovo progetto di ricerca che si propone di amplificare l'efficacia antitumorale di doxorubicina in cellule tumorali resistenti e non resistenti sfruttando le potenzialità dell'NO derivante da un NO-fotodonatore (NOPD). Per l'uso di NO come antitumorale, concentrazione e localizzazione sono aspetti molto importanti ed i fotodonatori rilasciano NO sotto stimolo luminoso con un'eccellente precisione spazio-temporale. Si sono progettati derivati della doxorubicina (DOXO-NOPDs) dove l'antitumorale è coniugato mediante diversi spacer con una sottostruttura NO-fotodonatrice a struttura nitroanilinica descritta in letteratura.(2) In questo lavoro di tesi tre derivati DOXO-NOPDs sono stati caratterizzati per stabilità chimico-metabolica in varie condizioni (PBS pH 7.4, siero umano, terreno di coltura). I composti hanno mostrato caratteristiche diverse: il derivato DOXO-NOPD A buona solubilità, ma scarsa stabilità chimico-metabolica; il derivato DOXO-NOPD B buona stabilità accompagnata da ridotta solubilità nelle condizioni operative; il derivato DOXO-NOPD C ottime solubilità e stabilità. Una parte importante del lavoro ha poi riguardato lo studio del rilascio di NO per via fotochimica dei DOXO-NOPDs rispetto al fotodonatore di riferimento. A studi esplorativi effettuati con varie lampade (lampada a vapori di mercurio a media pressione e lampada di Wood) è seguita la realizzazione di una lampada ad hoc con sorgente a led blu (centrato sulla λ di massimo assorbimento dei fotodonatori), capace di esaltare le proprietà NO-fonatrici dei composti, ma soprattutto utilizzabile negli esperimenti in vitro su cellule tumorali. I derivati A e B hanno mostrato un rilascio comparabile al fotodonatore di riferimento, mentre il derivato C possiede capacità di rilascio di NO inferiori. Tali risultati sono stati confermati da studi preliminari in vitro condotti su cellule tumorali melanoma M14 DOXO-resistenti, che hanno inoltre evidenziato che l'NO rilasciato fotochimicamente può essere una valida strategia per potenziare l'attività della DOXO su cellule resistenti.