Effetto di 1-butanolo sulla trascrizione da parte dei promotori UASINO e UPRE e sulla crescita di ceppi di Saccharomyces cerevisiae contenenti il plasmide pESC-OLE1

I biocarburanti sono considerati sostituti dei carburanti derivati dai combustibili fossili. Da alcuni anni, il biobutanolo suscita in campo industriale un notevole interesse per la possibilità di essere utilizzato come un potenziale additivo delle benzine. L'1-butanolo è prodotto naturalmente dai batteri Clostridia species attraverso la via di fermentazione acetone - butanolo - etanolo (ABE). La via di fermentazione ABE è stata introdotta nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Questo lievito è un organismo robusto e può crescere in varie condizioni, ma un fattore limitante è la sua sensibilità al butanolo. Gli obiettivi di questo studio sono due: (1) analizzare l'effetto del butanolo sulla trascrizione di geni da parte dei promotori UASino e UPRE nel lievito S. cereviasie, (2) osservare l'effetto dell'1-butanolo sulla crescita del ceppo di lievito Saccharomyces cerevisiae mutato, ACC1 S/A, contenente il gene OLE1. (1) Il promotore UASINO e i corrispondenti fattori che agiscono in trans (Ino2p, Ino4p, Opi1p) regolano la trascrizione dei geni coinvolti nella sintesi dei fosfolipidi. Il processo di risposta dell'UASINO sembra essere correlato all'unfolded protein response (UPR), la risposta cellulare che si verifica in caso di stress, in particolare quando vi è un accumulo di proteine dispiegate nel lume del reticolo endoplasmatico. In questo studio sono stati usati due plasmidi: il plasmide JH359 contenente il promotore UASINO e il plasmide JC104 contenente il promotore UPRE. Con questi due plasmidi i ceppi di lievito BY4742 e FY1679-28C sono stati trasformati. Il saggio della β-galattosidasi è stato svolto per analizzare i livelli di attività della β-galattosidasi per pJC104 e pJH359 in BY4742 e in FY1679-28C. Considerando che quando i promotori sono attivati, il lacZ è trascritto e che l'mRNA è tradotto in β-galattosidasi, quest'ultimo può essere usato come readout per l'induzione dei geni di UASINO (pJH359) e di UPRE (pJC104). In seguito, per valutare l'espressione dei geni, è stata utilizzata la tecnica di qRT-PCR. I risultati del saggio della β-galattosidasi e della qRT-PCR mostrano chel'1-butanolo overesprime i geni trascritti dall'UPRE. Invece, la trascrizione dei geni dell'UASino non è indotta dalla presenza di 1-butanolo. (2) Il ceppo di lievito mutato ACC1 S/A, dove la serina 1157 è mutata in un residuo di alanina, contiene il gene OLE1, che codifica per un enzima che forma il doppio legame nella catena degli acidi grassi saturi. In questo studio è stato usato il plasmide pESC-His. È stata applicata la diluizione seriale per comparare la crescita acc1S/A con pESC(-His)-OLE1 e la crescita del ceppo di lievito acc1S/A pESC-His privo del gene OLE1. Le piastre mostrano che in presenza del gene OLE1, il ceppo di lievito mutato ACC1 S/A sembra tollerare meglio il butanolo. Alla luce del fatto che l'OLE1 codifica per Δ-9 desaturasi, che forma il doppio legame negli acidi grassi saturi, il secondo passo di questo studio era osservare, tramite gas-cromatografia, se i ceppi acc1S/A contenenti pESC-OLE1 mostrassero un aumento della quantità di C18:1 e C16:1 o C18:0 e C16:0 (il primo numero indica il numero di atomi di carbonio nella catena e il secondo numero indica il numero di insaturazioni nella catena). Purtroppo non è stato possibile fare questo esperimento poiché i ceppi di lievito non sono cresciuti nel terreno liquido.

Biofuels are considered as substitutes for fossil resources in production of fuels. Recently biobutanol has been generated attention as a potential gasoline additive. 1-Butanol is produced naturally by the Clostridia species of bacteria through the acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation pathway. The ABE production pathway was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae. This yeast is a robust industrial organism that can grow under various industrial conditions, but a limiting factor is the butanol-sensitivity of S. cerevisiae. The purposes of this study are two: (1) to analyse the effect of 1-butanol on the transcription from UASINO and UPRE promoters in yeast, Saccharomyces cerevisiae (2) to observe the effect of 1-butanol on the growth of ACC1S/A mutant yeast Saccharomyces cerevisiae strain, containing the OLE1 gene. (1) The inositol-responsive cis-acting element (UASINO) and the corresponding trans-acting factors (Ino2p, Ino4p, Opi1p) are involved in the transcriptional regulation of phospholipid synthesis genes. The UASINO response pathway seems to be linked to the unfolded protein response (UPR), the cellular response that assists in case of ER stress, in particular when there is an accumulation of misfolded and unfolded proteins. In this study two plasmids were used: the JH359 plasmid contains the UASINO promoter and JC104 plasmid, the UPRE promoter. With these two plasmids, the yeast strains BY4742 and FY1679-28C were transformed. The β-galactosidase assay was performed in order to analyse the β-galactose activity levels for pJC104 and for pJH359 in BY4742 and also in FY1679-28C. Considering that when the promoters are activated the lacZ is transcribed and the mRNA is translated in β-galactosidase, it can be used as a readout for the induction of UASINO (pJH359) and UPRE genes (pJC104). Later to evaluate gene expression qRT-PCR was done. The β-galactosidase Assay and RT-qPCR results show that 1-butanol overexpress UPRE target genes. Whereas, the transcription of UASINO target genes isn't induced by 1-butanol. (2) The ACC1S/A mutant yeast strain, where serine 1157 is mutated to an alanine residue, contains the OLE1 gene, that encodes for an enzyme that forms a double bond in saturated fatty acyl CoA substrates. In this study the pESC-His plasmid was used. Serial dilution was done in order to compare the growth of the acc1S/A with pESC-(His)-OLE1 and the growth of the strains acc1S/A pESC-His, containing the empty factor. The agar plates show that the presence of the OLE1 gene seems to be helpful to increase the tolerance of the strain to 1-butanol. In light of the fact that OLE1 encodes for Δ-9 fatty acid desaturase, that forms a double bond in saturated fatty acyl CoA substrates, the second step of this study was to use gas chromatography for looking if acc1S/A strain containing pESC-OLE1 show an increase of the amount of C18:1 and C16:1 or C18:0 and C16:0 (the first number indicates the length of the chain of carbons and the second number indicates the number of insaturations in the chain). Unfortunately it couldn't be possible to do this experiment because the strains didn't grow in the liquid medium.