Identificazione ed analisi di espressione di DNA metiltrasferasi e demetilasi in Solanum melongena L.

Solanum melongena L. is an annual plant belonging to the Solanaceae family. The fruit is a berry whose edible part is the flesh. Most of the processes of differentiation and cellular development are controlled by epigenetic changes, consisting in DNA and chromatin modifications that affect the genome and gene expression without altering the nucleotide sequence of the DNA. The mainly studied epigenetic changes are DNA methylation, chromatin structure and histone modifications. In particular methylation in plants mainly occurs at cytosine level. The final level of DNA methylation is determined by the joint action of enzymes involved in methylation, such as methyltransferase (DRM, MET, CMT, DNMT2) and demethylase (ROS, DME, DML2, DML3). DNA methylation becomes a pivotal system in transcription regulation playing a key role in plant development and fruit maturation. It is therefore of paramount importance to acquire more information on the dynamics of the epigenome reprogramming through the activity of methyltransferases and demethylase. The objective of my thesis consisted in the isolation of DNA methyltransferase and demethylase in eggplant, as well in the analysis of their gene expression level during fruit ripening. The sequences of 7 methyltransferase (MET1, CMT1, CMT2, CMT3, DRM1, DRM2, DNMT2) and 1 demethylase (DME) have been identified within the eggplant proteome. Secondly, a detailed analysis of protein domains was performed through PFAM program, which confirmed the presence of all the typical conserved domains of methyltransferase and demethylase within the isolated sequences. The isolated genes were analyzed for their expression level in four commercial varieties of eggplant (CLARA, BELLA ROMA, BIG GREEN SLIM JIM), chosen for their differences in peel and flesh colour and shape of the fruit. 4 growth stages of maturation and development of the fruit were chosen: fruit set, intermediate berry development, fruit at the commercial stage and fully ripe fruit. The expression level of MET1 increased up to commercial stage and then decreased in ripe fruit stage in all varieties. CMT expression was observed to be rather stable until the commercial stage, with a subsequent decrease in the fully ripe stage with the exception of CMT2 that showed the highest value in the fully-ripe phase. No statistically significant differences during the berry ripening were observed for DNMT2. The expression level of DRM1 and DRM2 increased up to commercial stage and then decreased in ripe fruit stage. For DME, two opposite trends of expression were observed in the analyzed varieties: the first characterized by a decrease of gene expression level during the maturation phase of the fruit in Clara and Big Green varieties, the second by a constant gene expression level during the first three stages and an increase in fully ripe stage in Bella Roma and Slim Jim varieties.

Solanum melongena L. è una pianta annuale appartenente alla famiglia delle Solanaceae. Il frutto è una bacca la cui parte edibile è la polpa. La maggior parte dei processi di differenziamento e di sviluppo cellulare sono controllati da cambiamenti epigenetici, modificazioni del DNA e della cromatina che influenzano il genoma e l'espressione genica senza alterare la sequenza nucleotidica del DNA. I cambiamenti epigenetici principalmente studiati sono la metilazione del DNA, la struttura della cromatina e le modificazioni degli istoni. In particolare la metilazione nelle piante avviene principalmente a carico delle citosine presenti. Il livello finale di DNA metilato è definito dall'azione congiunta di enzimi coinvolti nella metilazione, le metiltrasferasi (DRM, MET, CMT, DNMT2) e le demetilasi (ROS, DME, DML2, DML3). La metilazione del DNA diventa quindi un vero e proprio sistema che partecipa alla regolare trascrizione dei geni svolgendo un ruolo essenziale nello sviluppo delle piante e maturazione del frutto. Diventa quindi di fondamentale importanza dal punto di vista della ricerca acquisire maggiori informazioni sulle dinamiche della riprogrammazione dell'epigenoma a carico delle metiltransferasi e demetilasi. Il mio lavoro di tesi si è basato sull'isolamento delle sequenze di DNA metiltransferasi e demetilasi in melanzana, per poi studiarne i livelli di espressione durante la maturazione del frutto. Le sequenze di 7 metiltransferasi (MET1, CMT1, CMT2, CMT3, DRM1, DRM2, DNMT2) e di 1 demetilasi (DME) sono state identificate all'interno del proteoma di melanzana. È stata fatta successivamente un'analisi dei domini proteici tramite il programma PFAM, che ha confermato la presenza di tutti i domini conservati tipici delle metiltransferasi e delle demetilasi all'interno delle sequenze isolate. I geni isolati sono stati quindi analizzati dal punto di vista dell'espressione genica in 4 varietà commerciali di melanzana (CLARA, BELLA ROMA, BIG GREEN, SLIM JIM), scelte per le differenze del colore della buccia, polpa e forma del frutto, selezionando 4 stadi fenologici della maturazione e sviluppo del frutto: allegagione, bacca in formazione, maturazione commerciale e maturazione fisiologica. Per la metiltransferasi MET1 si è osservato in tutte le varietà un aumento dell'espressione genica fino alla fase di maturazione commerciale e un decremento nella fase di maturazione fisiologica. Per le CMT si è osservata in tutte le varietà un'espressione pressoché stabile fino alla fase di maturazione commerciale, e una successiva diminuzione nella fase di maturazione fisiologica ad eccezione di CMT2 che mostra il valore più alto di espressione genica nella fase di maturazione fisiologica. Nel caso di DNMT2 non si sono osservate differenze statisticamente significative durante la maturazione della bacca. Per DRM1 e DRM2 in tutte le varietà è stato osservato un aumento con il progredire della maturazione fino al raggiungimento della fase di maturazione commerciale, con una conseguente diminuzione nella fase di maturazione fisiologica. Per DME, sono stati osservati due trend di espressione opposti nelle varietà analizzate: il primo caratterizzato da una diminuzione dell'espressione genica durante le fasi di maturazione del frutto nelle varietà Clara e Big Green, il secondo da un'espressione costante durante le fasi giovanili del frutto e una fase di aumento nella fase di maturazione fisiologica nelle varietà Bella Roma e Slim Jim.