ANALISI IN VITRO DELLA REAZIONE DI UBIQUITINAZIONE DELLA FOSFATIDILINOSITOLO 4-CHINASI II ALFA DA PARTE DELLA ITCH E3 LIGASI

La reazione di ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale reversibile che avviene per formazione di un legame isopeptidico tra il gruppo carbossilico di una glicina posta all'estremità C-terminale della molecola di ubiquitina (proteina di 76 aminoacidi) e il gruppo ε-amminico di un residuo di lisina nel substrato. In particolare, il trasferimento dell'ubiquitina al substrato è definita da una sequenza di tre passaggi catalizzati da altrettanti specifici enzimi: E1, enzima che attiva l'ubiquitina attraverso la formazione, ATP-dipendente, di un legame tioestere; E2, enzima coniugante l'ubiquitina che riceve la molecola per transtiolazione; E3, enzima ubiquitina ligasi che permette il passaggio dell'ubiquitina ad una lisina della catena laterale del target, oltre a definire il tipo di ubiquitinazione (mono-, multi- o poli-) (Rotin & Kumar 2009). L'ubiquitinazione determina il destino delle proteine, indirizzandole verso la degradazione proteasoma-dipendente, regola l'endocitosi, controlla l'attivazione di proteine chinasi e svolge un importante ruolo nel riparo del DNA. Questa tesi ha l'obiettivo di analizzare la reazione di ubiquitinazione in vitro del substrato fosfatidilinositolo 4-chinasi IIα (PI4KIIα), verificando che l'enzima Itch umano sia effettivamente l'E3 ligasi responsabile del processo. PI4KIIα assume un ruolo chiave all'interno del complesso enzimatico che regola il ciclo delle vescicole sinaptiche (Guo et al. 2003), mentre Itch è una E3 ligasi appartenente alla famiglia HECT, la cui peculiarità risiede in un residuo cisteinico altamente conservato che forma un legame tioestere con la porzione C-terminale dell'ubiquitina prima di catalizzarne il passaggio al substrato (Rotin & Kumar 2009). Il progetto nasce dall'osservazione dei risultati ottenuti con la reazione di ubiquitinazione condotta in vivo, che ha mostrato come la chinasi subisca una multiubiquitinazione ad opera dell'enzima Itch. Lo studio propone inizialmente il saggio per testare l'attività autocatalitica di Itch, che viene comparata con la forma cataliticamente inattiva dell'enzima (Itch inattivo): si è osservato che Itch effettivamente subisce un'autoubiquitinazione, condizione che non si verifica in corrispondenza di Itch inattivo; successivamente viene presentato un secondo confronto tra l'ubiquitinazione di PI4KIIα wild type e la sua forma mutante (PI4KIIα SF), incapace di interagire correttamente con Itch. Modificando opportunamente alcuni aspetti della reazione, come il tempo di incubazione e le quantità dei reagenti, si sono ottenute condizioni che consentono di osservare una sostanziale differenza tra il comportamento delle due proteine: il wild type viene ubiquitinato molto più efficacemente della forma mutante.