Ciclosporina A e lipoproteine per il trattamento delle malattie infiammatorie intestinali

Ulcerative colitis is a chronic inflammatory disorder of the colonic mucosa due to a dysregulation of immune system, which starts in the rectum and generally extends proximally through the entire colon. More than 20% of adults are affected by colitis, characterized by bloody diarrhea, abdominal pain and weight loss. The medical management is composed of various treatments including 5-amino-salycilic acid as first line therapy and cyclosporin A (CycloA), that selectively inhibits immune responses mediated by T-lymphocytes and B-lymphocytes function, for patients affected by moderate to severe active ulcerative colitis1. Nevertheless, due to high molecular weight and rigid cyclic structure, CycloA has a low and highly variable oral bioavailability that is reduced even more in presence of P-glycoprotein (P-gp) efflux from the enterocytes and extensive pre-systemic metabolism in the gut wall or in patients with diarrhea and various inflammatory bowel diseases. For these reasons, intravenous infusion, that assures constant blood concentrations and immediate benefit, is normally preferred. Moreover, because a major limitation in the treatment of inflammatory bowel disease is the inability to deliver the drug selectively towards the inflamed tissues, various nanotechonology-based drug delivery systems were developed such as lipoprotein systems. Lipoproteins, indeed, are non-immugenic and biocompatible natural carriers that can be utilized for the transport of hydrophobic drugs, such as CycloA. The present preliminary study aimed to prepare three lipoprotein formulations (HDL, LDL and VLDL-based) loaded with CycloA and CETP2 (cholesteryl ester transfer protein, a glycoprotein that has been shown to facilitate the transfer of CE, triglycerides, phospholipids and CycloA between different plasma lipoprotein particles) for the treatment of colitis in a murine model and to increase their stability with the addition of 1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocoline (23:2 Dyine PC) and the preparation of liposomes. Accordingly, we developed a dosage of CycloA associated with lipoproteins and a solid/liquid extraction method. The quantity of CycloA encapsulated in the preparations with or without CETP was dosed using a HPLC system, finding out that the presence of CETP lead to an increase of the encapsulation of CycloA in HDL and LDL formulations. Successively, after an intravenous injection of a drug dose of 2 mg/kg or 4 mg/kg, clinical activity (colon weight/length ratio) and therapeutic effects (evaluated by the inflammatory markers MPO, TNF-α, IL6 and IL-1β) were compared to the untreated colitis control group in mice. Finally, the consequences of the addition of Dyine PC and the preparation of liposomes were evaluated in terms of stability.

La colite ulcerosa è una malattia infiammatoria cronica intestinale che coinvolge inizialmente la mucosa del retto per poi estendersi all'intero colon e che è causata principalmente da un errato funzionamento del sistema immunitario. Più del 20% degli adulti è affetto da colite, caratterizzata da diarrea sanguinante, dolore addominale e perdita di peso. Il trattamento può prevedere diverse terapie farmacologiche; tra i farmaci utilizzati si annovera la ciclosporina A (CycloA) capace di inibire selettivamente la risposta immunitaria mediata dai linfociti T e i linfociti B e che si è dimostrata efficace nei pazienti affetti da colite ulcerosa acuta.1 Uno dei maggiori limiti del trattamento farmacologico delle malattie infiammatorie intestinali rimane però la difficoltà di trasportare selettivamente il farmaco ai tessuti infiammati. Per questo motivo sono stati sviluppati sistemi nanotecnologici per il trasporto di farmaci quali, ad esempio, vettori che utilizzano le lipoproteine. Queste molecole sono dei carrier naturali, biocompatibili e non immunogenici che possono essere utilizzati per il trasporto di farmaci idrofobici come la CycloA. Lo scopo del presente studio preliminare è stato quindi la preparazione di tre formulazioni lipoproteiche (basate su HDL, LDL e VLDL) veicolanti la CycloA e la CETP2 (proteina di trasporto del colesterolo estere) per il trattamento della colite in un modello animale murino; inoltre si è tentato di aumentare la stabilità delle formulazioni tramite l'aggiunta del Dyine fosfocolina (PC) e la preparazione di liposomi. A questo scopo sono stati messi a punto diversi metodi di dosaggio della CycloA libera, della CycloA associata con le lipoproteine e un metodo di estrazione solido/liquido. La quantità di CycloA incapsulata nelle lipoproteine in presenza o assenza di CETP è stata dosata usando un sistema HPLC e ciò ha evidenziato che l'aggiunta di CETP aumenta l'incapsulazione di CycloA nelle formulazioni di HDL e LDL. Successivamente è stato valutato l'effetto dell'aggiunta del Dyine PC e della preparazione dei liposomi in termini di stabilità. Infine, l'attività clinica (rapporto peso/lunghezza del colon) e gli effetti terapeutici (valutati sulla base dei markers infiammatori MPO, TNF-α, IL6 e IL-1β) sono stati valutati utilizzando un modello murino ed iniettando per via endovenosa le diverse formulazioni (quantità di farmaco pari a 2 mg/kg o a 4 mg/kg). Lavori successivi saranno dedicati ad ottimizzare l'incapsulazione della CycloA nelle lipoproteine, ripetendo lo studio in vivo e approfondendo le tecniche per aumentare la stabilità delle formulazioni lipoproteiche.