Silenziamento allele-specifico con oligonucleotide antisenso come possibile approccio terapeutico nell'Atassia Spinocerebellare di tipo 1

Le Atassie Spinocerebellari (SCA) rappresentano un gruppo di malattie ereditarie autosomiche dominanti, caratterizzate da atrofia cerebellare, andatura instabile, difficoltà di coordinazione dei movimenti e disartria. Ad oggi sono note 42 forme diverse di SCA e solo per 30 di esse è stato identificato il gene causativo ed è in uso un test molecolare per la diagnosi. La SCA1 è una delle SCA più frequenti in Italia ed è causata dall'espansione di una tripletta CAG (Glutammina) nella regione codificante del gene Atassina 1. La malattia si manifesta quando la tripletta supera la soglia di 41 ripetizioni. Studi su larghe casistiche di pazienti hanno dimostrato che la lunghezza del tratto ripetuto in ATXN1 è direttamente correlata con la gravità dei sintomi. Ad oggi non è nota una terapia per la SCA1, ma alcuni studi indicano che il blocco della proteina espansa nel distretto citoplasmatico o la riduzione della sua espressione, possano avere un'importante applicazione terapeutica. In questo studio abbiamo sviluppato un sistema in vitro per valutare l'efficacia di silenziamento allele-specifico basato sulla tecnica dell'RNA interference (RNAi). Tale approccio permette di spegnere in maniera selettiva l'allele contenente l'espansione patologica del gene ATXN1 causativa della SCA1, preservando l'espressione dell'allele wild-type. Per prima cosa è stato identificato un polimorfismo (SNP-X) presente in eterozigosi nei pazienti della nostra casistica e ne è stata verificata la fase rispetto all'allele malattia. Una volta identificato l'allele in linkage con l'espansione (allele C), è stata creata una libreria di 19 siRNA da 19bp con bersaglio l'allele C dello SNP-X. La riduzione dei livelli di espressione del trascritto mutato è stata misurata utilizzando un sistema reporter, basato su un vettore esprimente il trascritto della Renilla, fuso con la regione di ATXN1 contenente i due alleli alternativi dello SNP-X e il trascritto della Luciferasi, usato come normalizzatore interno del saggio. I diversi siRNA sono stati co-trasfettati alternativamente in cellule HEK293 con il plasmide allele Renilla-ATXN1-C o allele Renilla-ATXN1-T, misurando al luminometro il rapporto Renilla/Luciferasi. I risultati ottenuti ci hanno permesso di individuare un siRNA in grado di ridurre l'espressione della Renilla-ATXN1-C in modo allele specifico, ma con una efficienza media, e tre siRNA capaci di ridurre l'espressione della Renilla in modo molto efficiente ad entrambe le concentrazioni sperimentali, ma non specifici per l'allele target C. Questo studio ha dimostrato l'efficacia e l'applicabilità dell'RNAi nella modulazione dell'espressione allelica del gene ATXN1, anche se vi sono ancora alcune limitazioni. Ad oggi, anche in altre patologie come la Corea di Huntington, la malattia di Alzheimer e forme familiari di sclerosi laterale amiotrofica, l'approccio di silenziamento allele-specifico in vitro e/o in modelli animali ha permesso di ottenere promettenti risultati, dimostrando l'elevato valore e l'applicabilità clinica di questa tecnica.