The detection of molecular recognition events plays a key role in different research fields, ranging from the study of cellular pathways to the development of biosensors. The detection of such events requires the labeling of one of the two interacting molecules; depending on the detection modalities, different markers can be used. In our laboratories novel highly stable and fluorescent markers based on indocyanine dyes entrapped within silica nanoparticles have been developed and characterized. In order to introduce functional groups for the anchoring of the biomolecule of interest on the surface of such nanoparticles, different functionalization strategies can be adopted. This research work deals with the surface functionalization of silica nanoparticles with the use of 3-aminopropyltriethoxysilane, in order to introduce free amino groups exploitable for the immobilization of biomolecules. Two different approaches were attempted, a one pot method and a post-synthesis grafting procedure. Size and morphology properties of the materials were assessed mainly by transmission electron microscopy, whilst the surface properties were investigated by FT-IR spectroscopy. The results showed that neither the one pot strategy nor the post synthesis grafting affected the final dimension and spherical morphology of the nanoparticles and the one pot method lead to the highest functionalization efficiency. It is well known that the interaction between proteins and materials can cause the unfolding of proteins, with subsequent losing of the biological function. Furthermore, recent studies showed that silica nanoparticles immersed in biological fluids are soon covered by protein and other biomolecules which adsorb on the surface by forming layers of different thickness in the nanometer range. Hence, it is necessary to investigate the features and consequences of the interaction between nanoparticle and proteins before starting with the immobilization of biomolecules of interest. In such scenery in the present research work the interaction between silica nanoparticles and BSA (bovine serum albumin) as model protein have been investigated. The amount of protein adsorbed in reversible and irreversible fashion was determined by the study of the adsorption isotherms. The effect of functionalization and of the coverage with proteins on the dispersibility and electric potential was studied by dynamic light scattering and zeta potential. The consequences of the interaction on the protein tertiary structure were investigated by ATR-FT-IR spectroscopy, circular dichroism and photoluminescence, both in steady state and time resolved mode. The obtained results evidenced a significant influence of the surface functionalization on the features of the interaction with proteins, both with respect to the presence/absence of functional groups and depending on the functionalization strategy adopted.
La rilevazione di eventi di riconoscimento molecolare è fondamentale in molti ambiti, dagli studi di meccanismi chiave a livello cellulare allo sviluppo di strumenti diagnostici basati su biosensori. La rilevazione di tali eventi prevede che uno dei partner d'interazione sia marcato con una sonda adeguata alla tecnica di detection utilizzata. Nei nostri laboratori sono state sviluppate e caratterizzate dal punto di vista fotofisico sonde per imaging ottico costituite da nanoparticelle altamente luminescenti e fotostabili basate sull'intrappolamento di indocarbocianine all'interno di una matrice silicea. Tali nanoparticelle devono essere funzionalizzate al fine di introdurre dei punti di ancoraggio per le biomolecole di interesse deputate alla funzione di riconoscimento. Questo lavoro di tesi concerne lo studio delle modalità di funzionalizzazione di superficie delle nanoparticelle al fine di rendere possibile la coniugazione con biomolecole di interesse. La scelta della strategia di funzionalizzazione è ricaduta sull'introduzione di gruppi amminici tramite l'utilizzo di molecole di 3-Aminopropiltrietossisilano. Al fine di mantenere inalterate il più possibile le dimensioni e la morfologia originali, sono state confrontate due tecniche di funzionalizzazione, una di tipo one-pot, in fase di preparazione delle nanoparticelle, ed una di grafting post-sintesi. I materiali ottenuti sono stati caratterizzati dal punto di vista morfologico e dimensionale tramite microscopia TEM, mentre le proprietà di superficie sono state studiate tramite spettroscopia FT-IR. I dati mostrano come entrambe le strategie adottate non modifichino significativamente né le dimensioni né la morfologia delle particelle, e l'efficienza di funzionalizzazione risulta essere nettamente maggiore nel caso della tecnica one-pot. E' noto che l'interazione di proteine con la superficie dei materiali può provocare la denaturazione delle stesse, con conseguente perdita delle peculiari funzioni biologiche. Inoltre, studi recenti hanno evidenziato che materiali silicei particellari immersi in un fluido biologico, vengono ricoperti di proteine e molecole che si adsorbono sulla superficie formando strati di spessore dell'ordine di diversi nanometri. Appare quindi evidente la necessità di studiare le caratteristiche di interazione materiale-proteina prima di procedere alla bioconiugazione. In questo contesto sono state indagate le caratteristiche di interazione tra nanoparticelle di silice non funzionalizzate/ammino-modificate e la BSA (albumina serica bovina) come proteina modello. La quantità di proteina in grado di adsorbirsi in modo reversibile e irreversibile è stata determinata mediante la costruzione di isoterme di adsorbimento. L'effetto del ricoprimento sulla disperdibilità e sul potenziale elettrico dei materiali è stato studiato tramite analisi DLS e potenziale zeta. In seguito, le conseguenze dell'interazione con la superficie del materiale sulla struttura proteica sono state indagate tramite spettroscopia FT-IR in modalità ATR nella regione del MIR, spettroscopia UV-Vis di dicroismo circolare e spettrofluorimetria, quest'ultima sia in stato stazionario sia risolto nel tempo. I risultati ottenuti indicano un'influenza significativa della funzionalizzazione superficiale sulle caratteristiche di interazione della proteina, sia in relazione alla presenza/assenza di tale funzionalizzazione, sia in riferimento alla strategia di funzionalizzazione adottata.
Effetto delle proprietà superficiali di nanoparticelle di silice sull'interazione con la proteina modello BSA
GAIA, ANNA
2010/2011
Abstract
La rilevazione di eventi di riconoscimento molecolare è fondamentale in molti ambiti, dagli studi di meccanismi chiave a livello cellulare allo sviluppo di strumenti diagnostici basati su biosensori. La rilevazione di tali eventi prevede che uno dei partner d'interazione sia marcato con una sonda adeguata alla tecnica di detection utilizzata. Nei nostri laboratori sono state sviluppate e caratterizzate dal punto di vista fotofisico sonde per imaging ottico costituite da nanoparticelle altamente luminescenti e fotostabili basate sull'intrappolamento di indocarbocianine all'interno di una matrice silicea. Tali nanoparticelle devono essere funzionalizzate al fine di introdurre dei punti di ancoraggio per le biomolecole di interesse deputate alla funzione di riconoscimento. Questo lavoro di tesi concerne lo studio delle modalità di funzionalizzazione di superficie delle nanoparticelle al fine di rendere possibile la coniugazione con biomolecole di interesse. La scelta della strategia di funzionalizzazione è ricaduta sull'introduzione di gruppi amminici tramite l'utilizzo di molecole di 3-Aminopropiltrietossisilano. Al fine di mantenere inalterate il più possibile le dimensioni e la morfologia originali, sono state confrontate due tecniche di funzionalizzazione, una di tipo one-pot, in fase di preparazione delle nanoparticelle, ed una di grafting post-sintesi. I materiali ottenuti sono stati caratterizzati dal punto di vista morfologico e dimensionale tramite microscopia TEM, mentre le proprietà di superficie sono state studiate tramite spettroscopia FT-IR. I dati mostrano come entrambe le strategie adottate non modifichino significativamente né le dimensioni né la morfologia delle particelle, e l'efficienza di funzionalizzazione risulta essere nettamente maggiore nel caso della tecnica one-pot. E' noto che l'interazione di proteine con la superficie dei materiali può provocare la denaturazione delle stesse, con conseguente perdita delle peculiari funzioni biologiche. Inoltre, studi recenti hanno evidenziato che materiali silicei particellari immersi in un fluido biologico, vengono ricoperti di proteine e molecole che si adsorbono sulla superficie formando strati di spessore dell'ordine di diversi nanometri. Appare quindi evidente la necessità di studiare le caratteristiche di interazione materiale-proteina prima di procedere alla bioconiugazione. In questo contesto sono state indagate le caratteristiche di interazione tra nanoparticelle di silice non funzionalizzate/ammino-modificate e la BSA (albumina serica bovina) come proteina modello. La quantità di proteina in grado di adsorbirsi in modo reversibile e irreversibile è stata determinata mediante la costruzione di isoterme di adsorbimento. L'effetto del ricoprimento sulla disperdibilità e sul potenziale elettrico dei materiali è stato studiato tramite analisi DLS e potenziale zeta. In seguito, le conseguenze dell'interazione con la superficie del materiale sulla struttura proteica sono state indagate tramite spettroscopia FT-IR in modalità ATR nella regione del MIR, spettroscopia UV-Vis di dicroismo circolare e spettrofluorimetria, quest'ultima sia in stato stazionario sia risolto nel tempo. I risultati ottenuti indicano un'influenza significativa della funzionalizzazione superficiale sulle caratteristiche di interazione della proteina, sia in relazione alla presenza/assenza di tale funzionalizzazione, sia in riferimento alla strategia di funzionalizzazione adottata.| File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14240/19726