La mutagenesi sito-specifica di residui aminoacidici dell'OSC umana rivela il ruolo critico del glutammato 459

L'ossidosqualene ciclasi (OSC) è uno degli enzimi più importanti e studiati della biosintesi degli steroli: catalizza la formazione del primo precursore ciclizzato degli steroli, nelle cellule animali e fungine, il lanosterolo, ed è considerato un buon target per farmaci antifungini ed ipocolesterolemici. Nel 2004 è stata risolta la struttura dell'enzima umano OSC[1]. L'analisi strutturale dell'OSC umana ha rivelato le caratteristiche essenziali del sito attivo ed ha evidenziato la presenza di due canali colleganti la cavità del sito attivo con la superficie della proteina, uno lipofilo verso la zona di inserimento dell'enzima nella membrana del reticolo endoplasmatico, uno polare verso il compartimento citosolico. Si suppone che il primo canale permetta al substrato ossidosqualene di accedere al sito attivo idrofobico. Il canale idrofobico è già stato studiato nell'enzima OSC di S. cerevisiae mediante mutagenesi sito-specifica dei residui aminoacidici coinvolti; questi studi hanno confermato il ruolo essenziale che ha, per la catalisi enzimatica, il mantenimento della struttura del canale[2]. Il ruolo del canale polare, che potrebbe rappresentare la via d'uscita del prodotto di ciclizzazione, non è stato ancora studiato. In base ai dati cristallografici, il residuo di glutammato E459 appare essere il residuo di collegamento tra il canale polare e la cavità interna del sito attivo: questo residuo è collegato mediante ponti idrogeno con i due residui aminoacidici di glutammina Q394 e lisina K462. In questa tesi è stato studiato l'effetto sull'attività catalitica della modifica dei residui E459 e Q394. I mutanti studiati sono: E459F ed E459L (in cui il glutammato è sostituito con residui dotati di ingombro sterico, come fenilalanina e leucina), E459Q ed E459D (in cui cambia la carica o la lunghezza della catena), Q394L (in cui la glutammina è sostituita con un residuo non capace di formare ponti idrogeno come la leucina con lo scopo di valutare l'importanza del ponte idrogeno tra questo residuo ed E459). I mutanti sono stati ottenuti mediante mutagenesi sito-specifica e sono stati espressi in cellule del lievito Pichia pastoris: l'espressione della proteina mutata è stata valutata mediante Western Blot e l'attività specifica delle proteine mutate presenti negli omogenati di cellule di P. pastoris è stata confrontata con quella della proteina OSC umana nativa. Tutti i mutanti E459 hanno attività inferiore a quella della proteina OSC nativa: in particolare i mutanti E/F ed E/L in cui cambiano polarità ed ingombro sterico, l'attività è ridotta del 90%. Il dato più interessante riguarda il mutante Q/L che risulta completamente inattivo. I dati ottenuti confermano l'importanza del canale polare nella capacità dell'OSC di formare il lanosterolo. Riferimenti bibliografici selezionati [1] Thoma R., Schulz-Gasch T., D'Arcy B., Benz J., Aebi J., Dehmlow H., Hennig M., Sthile M., Ruf A., (2004), Nature (432), 118-122. [2] Oliaro Bosso S., Caron G., Taramino S., Ermondi G., Viola F., Balliano G., (2011), PloS ONE (6), e22134