CLONAGGIO ED ESPRESSIONE DI UN MINI SISTEMA CELLULASICO IN LACTOCOCCUS LACTIS

Gli scarti lignocellulosiche, che abbondano in natura son oil substrato ideale per le strategie di ¿biorefinery¿ per produrre prodotti utili quali biocarburanti e plastiche biodegradabili attraverso la fermentazione microbica. Tuttavia la conversione tradizionale di questa biomassa è economicamente sfavorevole se fatta con i tradizionali processi multistep, inoltre non sono ancora stati isolati microrganismi in grado di metabolizzare i substrati (in particolare cellulosa) e produrre i prodotti di interesse attraverso un meccanismo single-step (Consolidated bioprocessing: CBP). A questo proposito l'obiettivo dell'ingegneria metabolica è trovare microrganismi ricombinanti adatti al CBP. L'espressione di proteine extracellulari eterologhe, provenienti da microrganismi del genere Clostridium (cellulasi o emicellulasi), è la caratteristica principale della ¿recombinant cellulolytic strategiy¿ che conferisce attività cellulolitica in microrganismi che presentano alte rese di prodotti. In particolare, il presente lavoro di tesi si inserisce in un progetto più ampio che mira allo sviluppo del ceppo L. lactisIL-1403 per la conversione di scarti lignocellulosici in acido lattico otticamente puro attraverso l'espressione del sistema cellulasico di C. cellulovorans. Per prima cosa si è provveduto all'ottimizzazione dei vettori precedentemente ottenuti, contenenti gli enzimi di interesse tra cui la cellulasi non cellulosomale engD e la β-glucano glucoidrolasi bglA, sia singolarmente che associati in un operone bicistronico. in modo tale da ridurre la distanza che intercorre tra l'RBS presente nel vettore pMG36ea e l'ATG dei diversi geni inseriti nel MCS, andando ad escludere la sequenza nucleotidica interposta tra questi due siti, che comprende anche l'ATG già presente nel vettore. I ricombinanti sono stati analizzati tramite reazione di amplificazione con PCR e reazioni di digestione usando gli enzimi di restrizione i cui siti di taglio si trovano all'interno del MCS del vettore. Infine è stata valutata l'attività enzimatica: CMCasica e β-glucosidasica dei ceppi ricombinanti ottenuti L. lactis IL-1403 (pMG36ea∆-bglA), L. lactis IL-1403 (pMG36ea∆-engD) e L. lactis IL-1403 (pMG36ea∆-bglA-engD). È stato riscontrato che il ceppo con l'operone bicistronico ha attività β-glucosidasica 6 volte maggiore a quella di L. lactis (pMG36eaΔ-bglA) e inoltre presenta attività CMCasica a differenza di L. lactis (pMG36ea∆-engD) : questo potrebbe essere dovuto ad una migliore secrezione e/o ad un effetto di sinergia catalitica tra i due enzimi.