Canali ionici coinvolti nella modulazione dell'eccitabilità elettrica di neuroni GnRH immortalizzati: possibile ruolo dei canali TRP

Neurons that release Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), the GnRH system, are the final common pathway responsible for the regulation of fertility in Vertebrates, through the regulation of synthesis and secretion of Luteinizing Hormone (LH) and Follicle-Stimulating Hormone (FSH). Many Authors have reported that these neurons can generate action potentials spontaneously; mechanisms that generate and modulate this electrical activity involve different populations of voltagegated channels and non voltage-gated channles. In particular, voltage-gated calcium channels induce fluctuations in the calcium intracellular concentration that are responsible of the pulsatile pattern of hormone release. Previous studies in the laboratory where I developed my thesis project have provided preliminary evidence that a TRPC-like current could be involved in the spontaneous and GnRH-induced electrical activity in GT1-7 cells (immortalized GnRH cell line). My thesis has dealt with recording the electrical activity of GT1-7 cells using the patch clamp technique in order to evaluate the contribution of voltage-gated Na+ and Ca2+ channels and of TRPC channels in the maintaining of the spontaneous electrical activity in GT1-7 cells. In current clamp experiments, I have employed a blocker of voltage-gated sodium channels, Tetrodotoxin (TTX), in GT1-7 cells that showed spontaneous electric activity. Similarly, the contribution of Ca2+ currents and of TRPC-like currents has been evaluated by treating cells, respectively, with Cd2+ ion (aspecific blocker of VGCC) and SKF96365 (aspecific blocker of TRPC channels). Finally, experiments of Calcium Imaging allowed to evaluate the biological effects of OAG (membrane-permeable analogue of DAG) in GT1-7 neurons. Preliminary data obtained in current clamp experiments have confirmed the involvement of voltage-gated sodium channels in the generation of action potentials during the oscillatory activity of the membrane potential. Moreover, it has been shown that voltage-gated calcium channels are responsible only partially for the oscillations of the membrane potential since these fluctuations are not completely eliminated in presence of Cd2+ and TTX. Treatment of GT1-7 cells with SKF96365 has confirmed the contribution of the TRPC-like currents in the shaping of the membrane potential during electric activity since the application of this blocker produced either the abolishment or the sharp reduction of the spontaneous oscillations of membrane voltage. Finally, the activation of several members of the TRPC family induced by OAG led to a significant rise in the calcium intracellular concentration in GT1-7 cells.

Il complesso dei neuroni che rilasciano il Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), o sistema GnRH, è la via finale comune responsabile della regolazione della fertilità nel Sistema Nervoso Centrale dei vertebrati, che avviene attraverso la regolazione della sintesi e della secrezione del Luteinizing Hormone (LH) e del Follicle-Stimulating Hormone (FSH). É stato osservato che questi neuroni sono in grado di generare potenziali d'azione in maniera spontanea e che i meccanismi tramite i quali l'attività di firing di potenziali d'azione è generata e modulata coinvolgono diverse popolazioni di canali voltaggio dipendenti e non. In particolare, i canali del Ca2+ voltaggio dipendenti permettono la generazione di oscillazioni della concentrazione intracellulare di Ca2+ che è responsabile dell'andamento pulsatile del rilascio dell'ormone. Precedenti studi condotti nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi hanno dimostrato che una corrente TRPC-like potrebbe essere coinvolta nell'attività di firing spontaneo e indotta da GnRH in neuroni GT1-7 (linea cellulare immortalizzata derivata da neuroni GnRH). In questo lavoro si è voluto valutare il ruolo dei canali del Na+ e del Ca2+ voltaggio dipendenti e dei canali appartenenti alla famiglia TRPC nel mantenimento dell'attività elettrica spontanea di neuroni GT1-7. Negli esperimenti di current clamp è stato utilizzato un bloccante dei canali del Na+ voltaggio dipendenti, la Tetrodotossina (TTX), su cellule GT1-7 che mostravano un'attività spontanea di firing di pda. Analogamente, si è valutato il contributo delle correnti di Ca2+ mediate dai canali del Ca2+ voltaggio dipendenti ed il contributo delle correnti TRPC-like tramite l'utilizzo, rispettivamente, dello ione Cd2+ (bloccante aspecifico dei canali del Ca2+ voltaggio dipendenti) e del SKF96365 (bloccante aspecifico dei canali TRPC). Infine, sono stati effettuati esperimenti di Calcium Imaging nei quali è stato utilizzato un attivatore di alcuni membri della famiglia TRPC, OAG (analogo membrana permeabile del DAG) con lo scopo di valutare la risposta di neuroni GT1-7. I dati raccolti attraverso gli esperimenti di current clamp hanno evidenziato il coinvolgimento dei canali del Na+ voltaggio dipendenti nella generazione dei potenziali d'azione durante l'attività oscillatoria del potenziale di membrana. Inoltre, i canali del Ca2+ voltaggio dipendenti si sono rivelati essere solo in parte responsabili dell'andamento oscillatorio del potenziale di membrana poiché queste oscillazioni non vengono completamente eliminate in presenza di Cd2+ e TTX. Gli esperimenti che prevedevano il trattamento con SKF96365 hanno confermato un contributo delle correnti sensibili al bloccante nel modellamento del potenziale di membrana durante l'attività di firing di potenziali d'azione poiché l'applicazione dello stesso provocava l'abolizione o la drastica riduzione delle oscillazioni spontanee. Infine, l'attivazione di alcuni membri della famiglia TRPC, tramite trattamento con OAG, porta ad un aumento significativo della concentrazione intracellulare di Ca2+ in cellule GT1-7.