Catestatin (Cts) is a 21-amino acid, cationic and hydrophobic peptide that is formed endogenously by proteolytic cleavage of its precursor chromogranin A, a major protein co-stored and co-released with catecholamines from the storage vesicles in neuroendocrine system. In the cardiovascular system Cts acts as a regulator of blood pressure, vascular tone and cardiac contractility. Recent reports demonstrated that Cts induces an antiadrenergic effect mediated by endothelial nitric oxide (NO). Previous researches performed by the Cardiac Physiology Laboratory, University of Turin, suggest that NO Cts-induced increase is Ca2+-independent and sensitive to the PI3K blocker Wortmannina (Wm). The hypothesis is that Cts induces the NO increase via the PI3K-Akt-eNOS pathway and the consequent phosphorylation of eNOS in Ser 1179, which activates the enzyme without the increase of intracellular calcium. Considering that, the aim of my work was to investigate the pathway induced by Cts to activate eNOS in endothelial cells and its effects on the caveolin-1 (Cav-1) displacement, further its induction of endocytosis processes. Western Blot experiments on BAE-1 cells show a significant increase of Akt phosphorylation after 15 minutes Cts 5nM incubation, compared with control cells and Cts+Wm treated cells. Moreover immunofluorescence data report an increase of eNOS phosphorylation in Cts treated cells, compared with control cells and Cts+Wm treated cells. Others immunofluorescence experiments were perfomed to investigate the displacement of Cav-1: the eNOS actvation, in fact, requires its detachment from the cellular membrane, where it is bound to Cav-1 in an inactive state. These data suggest that the incubation with Cts leads the diffusion of the Cav-1 molecules in the cytosol, whereas in the non treated cells and in Cts+Wm treated cells they are localized mainly on the cellular membrane. Given these evidences and its hydrophobic composition, in addition to the fact that is still not identified a specific receptor for Cts, the hypothesis is that it can activate endocytosis process in endothelial cells. To follow the endocytic vesicles traffic, BAE-1 cells were loaded with the membrane dye FM 1-43. In cells treated with Cts the fluorescence intensity, corresponding at the vesicles formation in the cytoplasm, increases compared with that one of the control and Cts+Wm treated cells. Those experiments confirm the endocytosis induction powered by Cts, but should be interesting investigate about the existence of a specific receptor or, more probably, about others non-receptorial membrane interaction mechanisms. According with this work the hypothesis that Cts effects are mediated by the endothelial production of NO can be confirmed. It is also possible conclude that Cts drive the eNOS phosphorylation by the PI3K-Akt pathway and then the NO increase in a Ca2+-independent way. Considering the organ level, these results could suggest the idea that the NO increase in cardiac tissue has as results the decrease of β-adrenergic effects and the consequent reduction of cardiac lusitropism and inotropism and the vascular relaxation.
La catestatina (Cts) è un peptide che si genera in seguito a clivaggio proteolitico del precursore cromogranina A. A livello del sistema cardiovascolare, la Cts è implicata nella regolazione della pressione arteriosa, nel controllo del tono vascolare e nella riduzione della contrattilità miocardica. Recenti studi hanno dimostrato che la Cts è in grado di indurre un effetto antiadrenergico mediato dall'Ossido Nitrico di origine endoteliale. Precedenti ricerche hanno evidenziato che l'aumento della sintesi di NO, indotto dalla somministrazione di Cts, è Ca2+-indipendente ed è bloccato dalla Wortmannina (Wm), noto inibitore della PI3K. Si è quindi ipotizzato che la Cts porti ad un aumento della produzione di NO tramite la via PI3K-Akt-eNOS con conseguente fosforilazione della eNOS. Lo scopo del mio lavoro è stato quello di indagare ulteriormente il pathway attraverso cui la Cts porta all'attivazione della eNOS nelle cellule endoteliali e quali effetti determini a livello del displacement della caveolina-1 (Cav-1) e dell'attivazione di processi di endocitosi. Gli esperimenti di Western Blot sulle cellule BAE-1 hanno dimostrato un aumento significativo della fosforilazione di Akt dopo il trattamento con Cts rispetto alle cellule non trattate e alle cellule trattate con Wm. Successivamente sono stati condotti esperimenti di immunofluorescenza i quali hanno dimostrato come il trattamento con la Cts porti ad un incremento della fosforilazione di eNOS nelle cellule endoteliali . Sono stati anche eseguiti esperimenti di immunofluorescenza per valutare l'azione della Cts sulla mobilitazione della Cav-1: l'attivazione della eNOS è strettamente collegata al suo distacco dalla membrana cellulare, dove si trova legata in forma inattiva. Da questi è emerso come la somministrazione di Cts porti ad una diffusione della Cav-1 all'interno del citosol. Alla luce di questi risultati e dal momento che non è ancora stato identificato un recettore di membrana per la Cts, si è ipotizzato, vista la sua natura idrofobica, che essa possa attivare processi di endocitosi nelle cellule endoteliali. Al fine di mettere in evidenza la formazione di vescicole di endocitosi, sono stati eseguiti esperimenti di microscopia confocale sulle cellule BAE-1 caricate con la sonda di membrana FM 1-43. I risultati ottenuti hanno dimostrato come, a seguito del trattamento con Cts, l'intensità di fluorescenza, corrispondente alla formazione di vescicole di endocitosi presenti all'interno del citoplasma, aumenti rispetto a quella delle cellule di controllo e a quelle trattate con Wm . Questi studi confermano l'induzione dei processi di endocitosi da parte della Cts, ma sarebbe in ogni caso interessante indagare sulla presenza di un recettore di membrana specifico o su altri meccanismi non recettoriali di interazione con la membrana plasmatica. Nel lavoro di tesi da me svolto si è quindi potuta confermare l'ipotesi secondo cui gli effetti della Cts possano essere mediati dalla sintesi di NO dall'endotelio. E' anche possibile concludere che la Cts porta alla fosforilazione della eNOS tramite la via PI3K-Akt e che questo determini un aumento dell'attività catalitica dell'enzima e quindi un incremento della produzione di NO Ca2+-indipendente. L'incremento della concentrazione di NO a livello cardiaco si tradurrebbe quindi nell'inibizione degli effetti β-adrenergici, con conseguente riduzione dell'inotropismo e del lusitropismo cardiaci e nel rilassamento della muscolatura liscia dei vasi.
Ruolo cardioprotettivo di una via di trasduzione attivata dalla catestatina in cellule endoteliali
FERRERO, MAURA
2010/2011
Abstract
La catestatina (Cts) è un peptide che si genera in seguito a clivaggio proteolitico del precursore cromogranina A. A livello del sistema cardiovascolare, la Cts è implicata nella regolazione della pressione arteriosa, nel controllo del tono vascolare e nella riduzione della contrattilità miocardica. Recenti studi hanno dimostrato che la Cts è in grado di indurre un effetto antiadrenergico mediato dall'Ossido Nitrico di origine endoteliale. Precedenti ricerche hanno evidenziato che l'aumento della sintesi di NO, indotto dalla somministrazione di Cts, è Ca2+-indipendente ed è bloccato dalla Wortmannina (Wm), noto inibitore della PI3K. Si è quindi ipotizzato che la Cts porti ad un aumento della produzione di NO tramite la via PI3K-Akt-eNOS con conseguente fosforilazione della eNOS. Lo scopo del mio lavoro è stato quello di indagare ulteriormente il pathway attraverso cui la Cts porta all'attivazione della eNOS nelle cellule endoteliali e quali effetti determini a livello del displacement della caveolina-1 (Cav-1) e dell'attivazione di processi di endocitosi. Gli esperimenti di Western Blot sulle cellule BAE-1 hanno dimostrato un aumento significativo della fosforilazione di Akt dopo il trattamento con Cts rispetto alle cellule non trattate e alle cellule trattate con Wm. Successivamente sono stati condotti esperimenti di immunofluorescenza i quali hanno dimostrato come il trattamento con la Cts porti ad un incremento della fosforilazione di eNOS nelle cellule endoteliali . Sono stati anche eseguiti esperimenti di immunofluorescenza per valutare l'azione della Cts sulla mobilitazione della Cav-1: l'attivazione della eNOS è strettamente collegata al suo distacco dalla membrana cellulare, dove si trova legata in forma inattiva. Da questi è emerso come la somministrazione di Cts porti ad una diffusione della Cav-1 all'interno del citosol. Alla luce di questi risultati e dal momento che non è ancora stato identificato un recettore di membrana per la Cts, si è ipotizzato, vista la sua natura idrofobica, che essa possa attivare processi di endocitosi nelle cellule endoteliali. Al fine di mettere in evidenza la formazione di vescicole di endocitosi, sono stati eseguiti esperimenti di microscopia confocale sulle cellule BAE-1 caricate con la sonda di membrana FM 1-43. I risultati ottenuti hanno dimostrato come, a seguito del trattamento con Cts, l'intensità di fluorescenza, corrispondente alla formazione di vescicole di endocitosi presenti all'interno del citoplasma, aumenti rispetto a quella delle cellule di controllo e a quelle trattate con Wm . Questi studi confermano l'induzione dei processi di endocitosi da parte della Cts, ma sarebbe in ogni caso interessante indagare sulla presenza di un recettore di membrana specifico o su altri meccanismi non recettoriali di interazione con la membrana plasmatica. Nel lavoro di tesi da me svolto si è quindi potuta confermare l'ipotesi secondo cui gli effetti della Cts possano essere mediati dalla sintesi di NO dall'endotelio. E' anche possibile concludere che la Cts porta alla fosforilazione della eNOS tramite la via PI3K-Akt e che questo determini un aumento dell'attività catalitica dell'enzima e quindi un incremento della produzione di NO Ca2+-indipendente. L'incremento della concentrazione di NO a livello cardiaco si tradurrebbe quindi nell'inibizione degli effetti β-adrenergici, con conseguente riduzione dell'inotropismo e del lusitropismo cardiaci e nel rilassamento della muscolatura liscia dei vasi.| File | Dimensione | Formato | |
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