Breastmilk, by virtue of its complex composition in biologically active nutritional and non-nutritional factors, is the food of first choice for infant nutrition and the best way to support the health and development of the baby. Recently, the presence of Milk-derived Mesenchymal Stromal Cells (MDMSCs) has been demonstrated in breast milk, but to date the precise characterization of these cells is lacking and their role is still unclear. In the present study, we characterized MDMSCs and investigated their potential contribution in the mechanisms of immunomodulation, neurodevelopment, and regulation of glucose homeostasis. Twenty-one milk samples were collected, including 18 of colostrum and 3 of transitional milk. MDMDSCs were isolated and cultured in DMEM (Dulbecco's modified Minimum Essential Medium), fortified with 10% fetal bovine serum, in flasks previously coated with fibronectin. Characterization of MDMSCs was performed by cytofluorimetry evaluating the expression of the main surface markers of MSCs: CD105, CD90 and CD73, and the expression of HLA-DR (Human Leukocyte Antigen DR), which is responsible for the presentation of non-self antigens to the immune system. In order to verify the stem profile of MDMSCs and evaluate their possible fetal origin, gene expression levels of OCT4 and NANOG (pluripotency markers) and SRY were analyzed. By Real Time PCR, the expression levels of TNF-alpha, IDO1 and OPN as immunomodulation markers; BDNF, NT-3 and NT-4 as neurotrophic markers; and GLUT-1 and GLUT-4 as glucose transport markers were determined and compared between MDMSCs isolated from colostrum and transitional milk and with PDMSCs. All cell lines evaluated were positive for the surface antigens CD105, CD 90 and CD73, and for mRNA expression of both OCT4 and NANOG; while they were negative for HLA-DR. Gene expression levels of TNF alpha, IDO1 and OPN were higher in these cells than in PDMSCs, with higher expression levels in colostrum than in transitional milk. Only BDNF and NT-4, and not NT-3, were positive in MDMSCs, to a lesser extent than in PDMSCs and with higher concentrations in colostrum. Gene expression of GLUT-1 and GLUT-4 was found to be reduced in MDMSCs compared with PDMSCs, and GLUT-1 also has higher expression levels in transitional milk while GLUT-4 is more highly expressed in colostrum. Both are found to be reduced in cells isolated from milk of pregnancies complicated by GDM compared with physiological pregnancies. In conclusion, we have shown that human milk is a source of mesenchymal stromal cells, a unique cell population involved in the processes of immune maturation, neurodevelopment, and neonatal glucose homeostasis. In addition, the absence of HLA-DR expression makes these cells optimal candidates for the development of allogeneic cell therapies, without the risk of rejection, and for the enrichment of pasteurized donated human milk intended for premature infants in intensive care.
Il latte materno, in virtù della sua complessa composizione in fattori nutrizionali e non-nutrizionali biologicamente attivi, è l’alimento di prima scelta per la nutrizione del neonato e la migliore soluzione per sostenere la salute e lo sviluppo del bambino. Recentemente è stata dimostrata la presenza nel latte materno di cellule stromali mesenchimali (Milk-Derived Mesenchymal Stromal Cells - MDMSCs), ma ad oggi manca la precisa caratterizzazione di queste cellule e il loro ruolo non è ancora chiaro. Nel presente studio abbiamo caratterizzato le MDMSCs e indagato il loro potenziale contributo nei meccanismi di immunomodulazione, neurosviluppo e regolazione dell’omeostasi del glucosio. Sono stati raccolti 21 campioni di latte, di cui 18 di colostro e 3 di latte di transizione. Le MDMDSCs sono state isolate e coltivate in DMEM (Dulbecco’s modified Minimum Essential Medium), addizionato con siero bovino fetale al 10%, in fiasche precedentemente rivestite con fibronectina. La caratterizzazione delle MDMSCs è stata eseguita mediante citofluorimetria valutando l’espressione dei principali marcatori di superficie delle MSCs: CD105, CD90 e CD73, e l’espressione di HLA-DR (Human Leucocyte Antigen DR), responsabile della presentazione di antigeni non-self al sistema immunitario. Al fine di verificare il profilo staminale delle MDMSCs e valutarne la possibile origine fetale, sono stati analizzati i livelli di espressione genica di OCT4 e NANOG (marcatori di pluripotenza) e SRY. Mediante Real Time PCR sono stati determinati i livelli di espressione di TNF-alfa, IDO1 e OPN, quali marcatori di immunomodulazione; BDNF, NT-3 e NT-4 quali marcatori neurotrofici e GLUT-1 e GLUT-4 quali marcatori di trasporto del glucosio, confrontandoli tra MDMSCs isolate da colostro e da latte di transizione e con PDMSCs (Placenta-Derived Mesenchymal Stromal Cells). Tutte le linee cellulari valutate sono risultate positive per gli antigeni di superficie CD105, CD 90 e CD73, e per l’espressione di mRNA sia di OCT4 che di NANOG; mentre sono risultate negative per HLA-DR. I livelli di espressione genica di TNF alfa, IDO1 e OPN sono risultati più alti in queste cellule rispetto alle PDMSCs, con livelli di espressione maggiore nel colostro rispetto al latte transizionale. Solo BDNF e NT-4, e non NT-3, sono risultati positivi nelle MDMSCs, in misura minore rispetto alle PDMSCs e con concentrazioni maggiori nel colostro. L’espressione genica di GLUT-1 e GLUT-4 è risultata ridotta nelle MDMSCs rispetto alle PDMSCs, inoltre GLUT-1 presenta livelli di espressione più elevati nel latte di transizione mentre GLUT-4 è maggiormente espresso nel colostro. Entrambi risultano ridotti nelle cellule isolate da latte di gravidanze complicate da GDM rispetto a gravidanze fisiologiche. In conclusione abbiamo dimostrato che il latte umano è fonte di cellule stromali mesenchimali, popolazione cellulare unica coinvolta nei processi di maturazione del sistema immunitario, di neurosviluppo e omeostasi del glucosio neonatali. Inoltre l’assenza di espressione di HLA-DR rende queste cellule candidate ottimali per lo sviluppo di terapie cellulari allogeniche, senza il rischio di rigetto, e per l’arricchimento del latte umano donato pastorizzato destinato ai neonati prematuri in terapia intensiva.
Caratterizzazione delle cellule stromali mesenchimali del latte umano. Possibili implicazioni cliniche.
MOLINARI, VIRGINIA
2021/2022
Abstract
Il latte materno, in virtù della sua complessa composizione in fattori nutrizionali e non-nutrizionali biologicamente attivi, è l’alimento di prima scelta per la nutrizione del neonato e la migliore soluzione per sostenere la salute e lo sviluppo del bambino. Recentemente è stata dimostrata la presenza nel latte materno di cellule stromali mesenchimali (Milk-Derived Mesenchymal Stromal Cells - MDMSCs), ma ad oggi manca la precisa caratterizzazione di queste cellule e il loro ruolo non è ancora chiaro. Nel presente studio abbiamo caratterizzato le MDMSCs e indagato il loro potenziale contributo nei meccanismi di immunomodulazione, neurosviluppo e regolazione dell’omeostasi del glucosio. Sono stati raccolti 21 campioni di latte, di cui 18 di colostro e 3 di latte di transizione. Le MDMDSCs sono state isolate e coltivate in DMEM (Dulbecco’s modified Minimum Essential Medium), addizionato con siero bovino fetale al 10%, in fiasche precedentemente rivestite con fibronectina. La caratterizzazione delle MDMSCs è stata eseguita mediante citofluorimetria valutando l’espressione dei principali marcatori di superficie delle MSCs: CD105, CD90 e CD73, e l’espressione di HLA-DR (Human Leucocyte Antigen DR), responsabile della presentazione di antigeni non-self al sistema immunitario. Al fine di verificare il profilo staminale delle MDMSCs e valutarne la possibile origine fetale, sono stati analizzati i livelli di espressione genica di OCT4 e NANOG (marcatori di pluripotenza) e SRY. Mediante Real Time PCR sono stati determinati i livelli di espressione di TNF-alfa, IDO1 e OPN, quali marcatori di immunomodulazione; BDNF, NT-3 e NT-4 quali marcatori neurotrofici e GLUT-1 e GLUT-4 quali marcatori di trasporto del glucosio, confrontandoli tra MDMSCs isolate da colostro e da latte di transizione e con PDMSCs (Placenta-Derived Mesenchymal Stromal Cells). Tutte le linee cellulari valutate sono risultate positive per gli antigeni di superficie CD105, CD 90 e CD73, e per l’espressione di mRNA sia di OCT4 che di NANOG; mentre sono risultate negative per HLA-DR. I livelli di espressione genica di TNF alfa, IDO1 e OPN sono risultati più alti in queste cellule rispetto alle PDMSCs, con livelli di espressione maggiore nel colostro rispetto al latte transizionale. Solo BDNF e NT-4, e non NT-3, sono risultati positivi nelle MDMSCs, in misura minore rispetto alle PDMSCs e con concentrazioni maggiori nel colostro. L’espressione genica di GLUT-1 e GLUT-4 è risultata ridotta nelle MDMSCs rispetto alle PDMSCs, inoltre GLUT-1 presenta livelli di espressione più elevati nel latte di transizione mentre GLUT-4 è maggiormente espresso nel colostro. Entrambi risultano ridotti nelle cellule isolate da latte di gravidanze complicate da GDM rispetto a gravidanze fisiologiche. In conclusione abbiamo dimostrato che il latte umano è fonte di cellule stromali mesenchimali, popolazione cellulare unica coinvolta nei processi di maturazione del sistema immunitario, di neurosviluppo e omeostasi del glucosio neonatali. Inoltre l’assenza di espressione di HLA-DR rende queste cellule candidate ottimali per lo sviluppo di terapie cellulari allogeniche, senza il rischio di rigetto, e per l’arricchimento del latte umano donato pastorizzato destinato ai neonati prematuri in terapia intensiva.| File | Dimensione | Formato | |
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