Patogenesi di Tomato yellow leaf curl Sardinia virus: co-infezione con Potato spindle tuber viroid e infezione di piante silenziate per RDR6

In the first study were made tomato agro-inoculation with: pBIN19 empty (mock = negative control), TYLCSV, PSTVd and PSTVd-TYLCSV mixed infections. Initially the symptoms were observed phenotypic shown by tomato plants with different types of infection, observing their progress over time and recording the worsening or improvement of symptoms with photographs. In the next step we do semi-quantitative analysis to determine the amount of TYLCSV, in his presence or not, and in plants infected with TYLCSV-PSTVd, by means of tissue print and Southern blot analysis. The Northern blot analysis, regarding the presence and amount of PSTVd, were carried out at the CNR of Bari and there were photos courtesy of detection resulting from the analysis. The PSTVd is a quarantine pathogen, a viroid circular ssRNA not coding, which induces in the plant, through yet unknown mechanisms, a clear manifestation of symptoms (reduction of size with an intense green color of the leaves). Looking at the Southern blot was noticed that the amount of viral DNA is present in smaller quantities in plants with TYLCSV-PSTVd compared to plants with only TYLCSV. From the latter we have been done analysis studies by Real-Time PCR to check the status of expression of genes involved in methylation in plants infected with only PSTVd, to see if the viroid induces over expression of these genes or a sub expression. It resulted, studying two plants infected with PSTVd in comparison with two plants mock, which has only one gene over expression which increases with increasing time (SAMS1). For this type of analysis in the future we will study the level of expression of these genes on all types of infection and with a greater number of plants per treatment, going to see if it is present or not over expression of genes involved in methylation. In the second study were studied NbRDR6i and wild type (wt) symptoms of plants infected with TYLCSV (with photos), and performed semi-quantitative analysis of the TYLCSV, by Southern blot. The experiment was carried out with 6 wt plants healthy, 6 RDR6i plants healthy, 6 wt plants infected and 6 RDR6i plants infected. Half of each type were grown at 20°C and the other half at 27°C. From a first visual analysis we have seen that wt plants and RDR6i plants infected by the virus present the same symptoms (leaf curl and yellowing), while at 27°C we have seen that RDR6i plants infected by the virus was more symptomatic than wt plants. The semi-quantitative study of the virus has been carried out to see if the virus is dependent or not to the RDR6. As a result, we have seen that the TYLCSV turns out to be more concentrated in plant wt at 27°C than at 20°C, while TYLCSV in the RDR6i plants is more concentrated at 20°C, time advanced after inoculation. Another result is that the concentration of TYLCSV is unchanged between RDR6i plants and wt plants at 20°C, and, at 27°C, TYLCSV is more concentrated in wt plants than RDR6i plants. From this experiment it can be concluded that the TYLCSV is not sensitive to RDR6, but it can be concluded that TYLCSV show a reduced activity at 20°C (by the temperature) and then it can better infect in plants silenced for RDR6 gene, while at 27°C it can somehow overcome the majority defenses of wt plants and replicate, but not with RDR6i plants (probable action of another RDR in making more effective silencing of virus).

Nel primo studio sono state effettuate agro-inoculazioni di pomodori con: pBIN19 vuoto (mock = controllo negativo), TYLCSV, PSTVd e infezioni miste TYLCSV-PSTVd. Inizialmente si sono osservati i sintomi fenotipici mostrati dalle piante di pomodoro con i diversi tipi di infezione, osservando il loro andamento nel tempo e registrando il peggioramento o miglioramento dei sintomi con fotografie. Come passaggio successivo si è proceduti alla determinazione semi-quantità di TYLCSV, e quindi alla sua presenza o meno, in piante infette da solo TYLCSV o infette da TYLCSV-PSTVd, mediante tecniche di Tissue Print e Southern blot. Le analisi di Northern blot, riguardanti la presenza e la quantità di PSTVd, sono state effettuate presso il CNR di Bari e ci sono state gentilmente concesse le foto derivanti dall'analisi di rilevamento. Il PSTVd è un patogeno da quarantena, viroide a ssRNA circolare non codificante, che induce nella pianta, tramite meccanismi ancora sconosciuti, una evidente manifestazione dei sintomi (una riduzione della taglia con una colorazione verde intensa delle foglie). Osservando i Southern blot si è notato che la quantità di DNA virale è presente in minor quantità in piante con TYLCSV-PSTVd rispetto a piante con solo TYLCSV. Da quest'ultima analisi sono stati fatti studi mediante Real-Time PCR per verificare lo stato di espressione dei geni coinvolti nella metilazione su piante infette da solo PSTVd, per capire se il viroide induca una sovraespressione o una sottoespressione di questi geni. E' risultato, studiando due piante infette da PSTVd in confronto a due piante mock, che solo un gene presenta una sovraespressione che aumenta con l'aumentare del tempo (SAMS1). Nel secondo studio effettuato sono stati studiati i sintomi di piante NbRDR6i e wilde type (wt) infette da TYLCSV (tramite foto), ed eseguito analisi semi-quantitative sul TYLCSV, mediante Southern blot. L'esperimento è stato effettuato su 6 piante wt sane, 6 piante RDR6i sane, 6 piante wt infette da TYLCSV e 6 piante RDR6i infette da TYLCSV. Metà di ogni tipologia sono cresciute a 20°C e l'altra metà a 27°C. Da una prima analisi visiva si nota come piante wt e RDR6i infette dal virus presentino gli stessi sintomi (arricciamento fogliare e loro ingiallimento), mentre a 27°C si nota che le piante RDR6i infette dal virus sono più sintomatologiche rispetto alle piante wt. Lo studio semi-quantitativo sul virus è stato effettuato per verificare se il virus è dipendente o meno dalla RDR6. Come risultato, si è visto che il TYLCSV risulta essere maggiormente concentrato in piante wt a 27°C rispetto a quelle a 20°C, mentre nelle piante RDR6i il TYLCSV è più concentrato a 20°C, a tempi avanzati dopo l'inoculo. Un altro risultato ottenuto è che la concentrazione di TYLCSV risulta invariata tra piante RDR6i e wt a 20°C, mentre a 27°C risulta essere più concentrato nelle piante wt rispetto a quelle RDR6i. Da questo esperimento si può concludere che il TYLCSV non sia sensibile alla RDR6, ma si può concludere che a 20°C il virus presenta un'attività ridotta (dovuta alla temperatura) e quindi infetti meglio su piante silenziate per il gene RDR6, mentre a 27°C riesca in qualche modo a superare la maggior parte delle difese delle piante wt e a replicarsi, ma non con le piante RDR6i (probabile azione di un'altra RDR più efficace nell'effettuare silenziamento sul virus).