Caratterizzazione genomica dei rabdomiosarcomi pediatrici

BACKGROUND. Rhabdomyosarcoma (RMS) represents the most frequent soft tissue sarcoma in pediatric age. Current multimodal treatment with poly-chemotherapy, radiotherapy and/or surgery has greatly improved the survival of these patients (70% at 5 years). Knowing more about their molecular characteristics would allow the creation of more effective treatment protocols, reduce toxicities, and improve survival even for patients with advanced or relapsed disease. AIM OF THE STUDY. The study, which is part of the SAR-GEN 2016 project, aims to characterize the genomic and clinical profile of a cohort of pediatric patients with Rhabdomyosarcoma, to identify any significant genetic abnormalities in the process of carcinogenesis and searching for possible therapeutic targets. MATERIALS AND METHODS. Fresh tumor samples from 10 patients with RMS and the corresponding blood sample were sequenced. Each sample was subjected to Whole Exome Sequencing (WES) analysis to identify somatic mutations according to the criteria: single-base mutations and small insertions/deletions identified with two independent software programs (VarScan, Mutect and Strelka), mutations supported by at least 10 mutated sequences, with allele frequency ≥5% and with at least 1% reads mapped to both DNA strands. Other selection criteria are: mutation belonging to a known sarcoma cancer gene, CADD score >10. Sequence software v.3.0.0 was used for CNA analysis: a gene was considered modified if more than 80% of its length is within an aberrant region. RESULTS. The total number of somatic mutations detected is 42,777 (min.372-max.21,700), of which those selected according to the reported criteria are 3,547 (min.19-max.3100). TMB (Tumor Mutational Burden), an index expressing the mutational burden in a given sample, was calculated: the median was 0.57 (min.0.30-max.49). The most frequently mutated genes (3/10 patients) are BAIAP3, DMD, EGFR, IGSF10, KRTAP10, MTOR, PPP1R9A. Nine recurrent mutations were found, the most significant being NRAS Q61K mutation. The samples analyzed are characterized by a high rate of Copy Number Alteration (CNA) including both gene amplifications and deletions: 45,347 amplifications and 522 deletions were identified. Based on these data, CNA burden, an index expressing the percentage of genome affected by CNA, was calculated: the median value stands at 81% (min.5.5%-max.100%): AKT1 and c-MYC are amplified in 9/10 samples. An analysis of all altered genes (mutated, amplified or deleted) shows that some cellular pathways are more involved: the TGF-beta pathway is the most significant. DISCUSSION AND CONCLUSIONS. The analyzed samples are characterized by a low mutational rate, reflecting the general trend in pediatric versus adult cancers, but have high numbers of CNAs. Our data confirm that the RAS/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways are frequently altered in this disease regardless of the presence or absence of driver fusion proteins. The treatment of patients with RMS requires continued investment in research projects to implement knowledge of tumor biology in order to lay the groundwork for new and increasingly efficient personalized treatment/care protocols to improve the survival of these patients.

BACKGROUND. Il Rabdomiosarcoma (RMS) è il sarcoma dei tessuti molli più frequente in età pediatrica. L’attuale trattamento multimodale con poli-chemioterapia, radioterapia e/o chirurgia, ha migliorato notevolmente la sopravvivenza di questi pazienti (70% a 5 anni). Conoscerne più a fondo le caratteristiche molecolari permetterebbe di creare protocolli di trattamento più efficaci, di ridurre le tossicità e di migliorare la sopravvivenza anche per i pazienti con malattia avanzata o recidivata. OBIETTIVO DELLO STUDIO. Lo studio, inserito all’interno del progetto SAR-GEN 2016, si propone di caratterizzare il profilo genomico e clinico di una coorte di pazienti pediatrici con Rabdomiosarcoma, per identificare eventuali anomalie genomiche significative nel processo di cancerogenesi e ricercando eventuali bersagli terapeutici. MATERIALI E METODI. Sono stati sequenziati i campioni tumorali a fresco di 10 pazienti con RMS e il corrispondente campione ematico. Ogni campione è stato sottoposto ad analisi Whole Exome Sequencing (WES) per identificare le mutazioni somatiche secondo i criteri: mutazioni a singola base e piccole inserzioni/delezioni identificate con due software indipendenti (VarScan, Mutect e Strelka), mutazioni supportate da almeno 10 sequenze mutate, con frequenza allelica ≥5% e con almeno l'1% di letture mappate su entrambi i filamenti di DNA. Altri criteri di selezione sono: mutazione appartenente ad un sarcoma cancer gene noto, CADD score >10. Per l’analisi dei CNA è stato utilizzato il software Sequenza v.3.0.0: un gene è stato considerato modificato se più dell’80% della sua lunghezza è all’interno di una regione aberrante. RISULTATI. Il totale delle mutazioni somatiche rilevate è di 42.777 (min.372-max.21.700), di cui quelle selezionate in base ai criteri riportati sono 3.547 (min.19-max.3100). È stato calcolato il TMB (Tumor Mutational Burden), un indice che esprime il carico mutazionale in un dato campione: la mediana risulta di 0,57 (min.0,30-max.49). I geni mutati più frequentemente (3/10 pazienti) sono BAIAP3, DMD, EGFR, IGSF10, KRTAP10, MTOR, PPP1R9A. Sono state riscontrate 9 mutazioni ricorrenti, di cui la più significativa è la mutazione di NRAS Q61K. I campioni analizzati sono caratterizzati da un elevato tasso di Copy Number Alteration (CNA) che comprendono sia amplificazioni che delezioni geniche: sono state identificate 45.347 amplificazioni e 522 delezioni. AKT1 e c-MYC sono amplificati in 9/10 campioni. In base a questi dati è stato calcolato il CNA burden, un indice che esprime la percentuale di genoma interessato da CNA: il valore mediano si attesta a 81% (min.5,5%-max.100%). Dall’analisi di tutti i geni alterati (mutati, amplificati o deleti) si evince che alcuni pathway cellulari sono più coinvolti: quello del TGF-beta è il più significativo. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI. I campioni analizzati sono caratterizzati da un basso tasso mutazionale, che riflette l’andamento generale dei tumori pediatrici rispetto a quelli dell’adulto, ma presentano un elevato numero di CNA. I nostri dati confermano che i pathway RAS/MEK/ERK e PI3K/AKT sono frequentemente alterati in questa patologia indipendentemente dalla presenza o meno di proteine di fusione driver. Per la cura dei pazienti con RMS è necessario un investimento costante in progetti di ricerca che permettano di implementare le conoscenze della biologia del tumore al fine di porre le basi di nuovi e sempre più efficienti protocolli di trattamento/cura personalizzati per migliorare la sopravvivenza di questi pazienti.