Identificazione di Campylobacter jejuni e coli da carne di pollo del commercio con metodi molecolari

The genus Campylobacter contains a low number of species than most bacteria, the most important species, from the nutritional point of view, is Campylobacter jejuni, this differs from Campylobacter coli because it is able to hydrolyze hippurate, hippuric acid salts, also, stands out among the foodborne pathogens because its genome was the first to be sequenced. jejuni is a bacillus, S-curved or spiral, with a single polar flagellum at one or both ends of the cell, is oxidase and catalase positive and growth is inhibited by NaCl ≥ 3.5% (w/w) or temperature ≤ 25° C. It is microaerophilic, requiring small amounts of oxygen (3-6%) and CO2 (10%) for growth, but that is inhibited by oxygen concentrations of 21%. The purpose of this study was to detect the presence of C. jejuni in chicken samples packaged, as these bacteria found in about 72% of chicken carcasses, and being responsible for 90% of cases of campylobacteriosis. Chicken was chosen as a test sample because it is the first vehicle of transmission of the organism and therefore the disease. For the analysis we used a molecular technique that is not based on the cultivation of microorganisms, represented by qPCR, and results were compared with the molecular identification of isolates obtained by traditional sampling. The sampling was done starting from pre-cut chicken purchased in supermarkets in the province of Turin. Following the sampling, these were isolated by traditional methods. He was then extracted and amplified DNA sequence specific for Campylobacter spp., C. jejuni and C. coli by polymerase chain reaction. Extractions and PCR are were made two type one for a qPCR (quantitative PCR) and one for Multiplex PCR (qualitative PCR). After performing PCR, in the case of Multiplex, the amplicons were analyzed by electrophoresis. This experimental work has confirmed some of the features of Campylobacter, such as the difficulty of growth on selective media, and has highlighted other. The media used to isolate Campylobacter have been shown to not be specific because the percentage of positive by traditional methods down from 32% to 4% with Multiplex PCR analysis after growth in the media of isolation. A high percentage of plates with colonies that look similar to Campylobacter, then positive, with the traditional analysis, proved to be really positive for the presence of C. jejuni by qPCR analysis. The isolates were found positive plates or more times with incubation in enrichment broth for 48 h. Using incubation periods of 48 h, we had positive growth of 50%. As part of the growth plate, the best results were obtained by growth on enrichment broths Bolton. Highlighting the only broths without blood, with Bolton's enrichment, Campylobacter had a higher growth of 53% compared with the use of Preston, while for broths containing blood, growth in Bolton with blood was 56% higher than incubation in Preston with blood.

Il genere Campylobacter contiene un numero basso di specie rispetto alla maggioranza dei batteri; la specie più importante, dal punto di vista alimentare, è Campylobacter jejuni, questa differisce da Campylobacter coli in quanto è in grado di idrolizzare l'ippurato, sali dell'acido ippurico; si distingue, inoltre, tra i patogeni di origine alimentare in quanto il suo genoma è stato il primo ad essere sequenziato. C. jejuni è un bacillo, ricurvo ad S o a spirale, che possiede un singolo flagello polare su una o entrambe le estremità della cellula; è ossidasi e catalasi positivo e viene inibito nella crescita con NaCl ≥ 3,5% (peso/peso) o con temperature ≤ 25°C. È microaerofilo, richiedendo piccole quantità di ossigeno (3-6%) e di anidride carbonica (10%) per la crescita, che invece risulta inibita con percentuali di ossigeno pari a 21%. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di rilevare la presenza di C. jejuni in campioni di pollo preconfezionati, essendo questi batteri riscontrati in circa il 72% delle carcasse di pollo, ed essendo i responsabili nel 90% dei casi di campylobacteriosi. È stato scelto il pollo come campione di analisi in quanto è il primo veicolo di trasmissione del microrganismo e quindi della malattia. Per l'analisi è stata utilizzata una metodica molecolare che non si basa sulla coltivazione dei microrganismi, rappresentata dalla qPCR, ed i risultati ottenuti sono stati comparati con l'identificazione molecolare degli isolati ottenuti dal campionamento tradizionale. Il campionamento è stato fatto partendo da pollo preconfezionato sezionato, acquistato nei supermercati della provincia di Torino. A seguito del campionamento, questi sono stati isolati tramite metodiche tradizionali. In seguito è stato estratto il DNA e amplificata la sequenza specifica per Campylobacter spp., C. jejuni e C. coli, attraverso la reazione a catena della polimerasi. Di estrazioni e PCR ne sono state fatte due tipologie una per la qPCR (PCR quantitativa) ed una per Multiplex PCR (PCR qualitativa). Dopo aver eseguito la PCR, nel caso della Multiplex, le sequenze amplificate sono state analizzate mediante elettroforesi. Questo lavoro sperimentale ha confermato alcune delle caratteristiche di Campylobacter, come per esempio la difficoltà di crescita su terreni selettivi, e ne ha evidenziate altre. I terreni utilizzati per isolare Campylobacter hanno dimostrato di non essere specifici in quanto la percentuale dei positivi con analisi tradizionale scende dal 32% al 4% con analisi Multiplex PCR dopo l'accrescimento sul terreno d'isolamento. Un'alta percentuale di piastre con colonie dall'aspetto simile a Campylobacter, quindi positive all'analisi tradizionale, si sono rivelate realmente positive alla presenza di C. jejuni tramite analisi con qPCR. Gli isolati o piastre positivi sono stati riscontrati maggiormente con tempi incubazione nei brodi di arricchimento di 48 h. Utilizzando periodi di incubazione di 48 h, abbiamo avuto la crescita positiva del 50%. Nell'ambito della crescita su piastra, i risultati migliori sono stati ottenuti dalla crescita su brodi di arricchimento Bolton. Evidenziando i soli brodi non contenenti sangue, con l'arricchimento Bolton, Campylobacter hanno avuto una crescita maggiore del 53% rispetto all'utilizzo del Preston; mentre per i brodi contenenti sangue, la crescita in Bolton con sangue è stata del 56% maggiore rispetto all'incubazione in Preston con sangue.