Monitoraggio della contaminazione da aflatossine (B1, B2, G1 e G2) in nocciole commerciali medinate cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa

Aflatoxins (AFs), difuranocoumarin compounds, are highly toxin secondary metabolites produced by the genus of Aspergillus, especially A. flavus and A. parasiticus. A. flavus produces aflatoxins B1 (AFB1) and aflatoxins B2 (AFB2), whereas A. parasiticus generates these B aflatoxins as well as aflatoxins G1 (AFG1) and aflatoxins G2 (AFG2). These fungi can grow on a wide variety of foods and feeds under favourable temperature and humidity. Generally, tropical conditions such as high temperatures and relative humidity, unseasonal rains during harvest and flash floods lead to fungal proliferation and AFs production. AFs have been found to contaminate a wide variety of important agricultural products word-wide, e.g. corn, wheat, rice, spices, dried fruits and nuts. These mycotoxins have been clearly identified as highly toxic, mutagenic, teratogenic and carcinogenic compounds and have been implicated as causative agents in human hepatic and extra hepatic carcinogenesis. The European Union (EU) fixed as maximum admitted level 8 µg kg-1 for aflatoxin B1, and 15 µg kg-1 for total AFs (B1, B2, G1 and G2) intended for further processing and level 5 µg kg-1 for aflatoxin B1, and 10 µg kg-1 for total AFs (B1, B2, G1 and G2) of in several products, such as groundnuts, nuts, dried fruits and ¿ready to eat¿ cereals (5). The aim of my study, during my stage, was to analyze a larger number of hazelnut samples collected in different stores of Northern Italy using an efficient, very sensitive and simple routine method to extract, purify and analyse simultaneously aflatoxins B1, B2, G1 and G2 by Liquid Chromatography-tandem mass spectroscopy with Electrospray Ionization (LC/ESI-MS/MS).

Le Aflatossine, chimicamente, sono composti derivanti dalla cumarina che vengono denominate con le sigle B1, B2 (rispettivamente metossi-difuro-cumarone e metossi-difuro-cumaro-lattone), G1, G2 (loro diidroderivati) e M1, M2 (metaboliti idrossilati rispettivamente di B1 e B2 che si riscontrano nel latte di lattifere alimentate con mangimi contaminati da aflatossine B1 e B2). Si tratta di metaboliti secondari prodotti da diverse specie fungine appartenenti al genere Aspergillus; in particolare, la specie A. flavus produce le aflatossine B1 e B2 mentre l'A. parasiticus induce la produzione delle aflatossine G1 e G2. A causa della loro tossicità, la loro possibile presenza negli alimenti costituisce oggi un motivo di crescente preoccupazione per la salute dei consumatori. La contaminazione è influenzata ampiamente dalle condizioni climatiche, geografiche, dalle pratiche di coltivazione, di conservazione e dal tipo di substrato interessato in quanto alcuni prodotti sono più suscettibili rispetto ad altri alla crescita fungina. Gli alimenti più esposti alla contaminazione diretta sono soprattutto cereali (mais, frumento, riso, orzo, segale, ecc.), frutta secca ed essiccata, legumi, spezie, caffè e cacao. Sulla base di studi tossicologici, l'Unione Europea (UE) ha fissato dei livelli massimi di concentrazione ammissibili su differenti alimenti contaminati: per esempio, la concentrazione massima consentita per l'aflatossina B1, è di 8 mg/kg in diversi prodotti, come le arachidi, le noci, la frutta secca e i cereali (Regolamento della Commissione Europea No.165/2010). Durante il periodo del tirocinio ho utilizzato una metodica sensibile e di facile utilizzo per monitorare la presenza di aflatossine in 100 campioni di nocciole acquistate nel nord Italia e provenienti da differenti zone di produzione per valutarne il livello di contaminazione. Tali nocciole presentavano caratteristiche diverse (sgusciate tostate, sgusciate non tostate, con guscio e in granella) e origine italiana o straniera. Il metodo di analisi ha previsto 3 fasi preparatorie: la macinatura e omogeneizzazione del campione; l'estrazione con l'utilizzo di una miscela metanolo: acqua (80:20) in presenza di NaCl come sale; il processo di purificazione/concentrazione mediante colonnine di immunoaffinità impaccate con gel di anticorpi specifici nei confronti delle micotossine ricercate. La quantificazione è stata eseguita attraverso un sistema cromatografico HPLC ifenato ad uno spettrometro di massa-massa (triplo quadrupolo) in modalità ESI (positive electrospray ionization) come rivelatore. Ai fini dell'analisi quantitativa, per compensare l'effetto matrice è stato utilizzato il metodo dello standard interno; lo standard scelto ed utilizzato è stata l'aflatossina M1, poiché affine a livello chimico, ma totalmente assente all'interno del campione. I risultati ottenuti hanno mostrato una minima contaminazione da micotossine, infatti, il valore massimo di concentrazione riscontrato è stato di 1,22 mg/kg che non supera il livello massimo di aflatossine stabilito dalla normativa Europea. Nella totalità delle nocciole analizzate, l'aflatossina che ha contaminato più campioni è stata la G1 e le nocciole sgusciate sottoposte a tostatura risultano più sensibili alla contaminazione rispetto a quelle crude. Per quanto riguarda le origini non è possibile affermare una maggiore contaminazione italiana rispetto a quella straniera poiché il numero di campioni italiani rispetto a quelli di provenienza straniera risulta nettamente maggiore.