Interferenza dell’RNA per il controllo della cicalina Scaphoideus titanus, vettore della flavescenza dorata della vite

Scaphoideus titanus is a leafhopper of Nearctic origin widespread in many viticultural areas of Europe. It is the main vector of Flavescence dorée phytoplasma (FDp), one of the most concerning grapevine pathogens because of its epidemic potential and the severe damage caused. FDp is included in the A2 EPPO list as a quarantine organism subject to mandatory control according to national regulations. In Italy, there is an obligation to uproot infected vines and to apply insecticide treatments against the vector. The prolonged use of insecticidal products, often broad-spectrum, leads to biodiversity loss in the vineyard and increases health risk for operators due to repeated exposure to these substances. The call from European institutions to reduce the use of synthetic chemicals for ecosystem protection has strongly pushed the research for the development of several alternative and more sustainable technologies, including RNA interference (RNAi). Exploiting the RNAi mechanism to silence vector-specific genes would minimize the impact on off-target insects due to the use of conventional insecticides while maintaining effective control of the target population. The present study was focused on the development of this technique on S. titanus, natural vector of FDp, and on Euscelidius variegatus, laboratory vector. The choice of potential target genes was derived from recent genome-wide studies that identified 11 genes considered promising targets for RNAi. From this list, three targets (eIF3a, PREB and Rpn6) were selected due to their low sequence homology with the honeybee (Apis mellifera), which was chosen as a representative species to be preserved within entomofauna. Double-stranded RNAs (dsRNAs) complementary to S. titanus sequences were produced choosing regions with lower sequence similarity to the honeybee and higher homology to E. variegatus, so that the same molecules could be used for both vector species. Newly emerged adult insects were microinjected with a solution containing dsRNAs and maintained on oat (E. variegatus) or grapevine (S. titanus) plants for 21 days. DsRNAs complementary to the Green Fluorescence Protein (GFP) sequence, which is absent in insects, were used as a control. At 3, 7, 14 and 21 days post injection, individuals were sampled for evaluation of silencing effects by RT-qPCR. The mortality rate was recorded daily. The effect of silencing was also analysed by evaluating theF1 progeny obtained from treated E. variegatus individuals and assessing the fertility of S. titanus through microscopic observation of the ovaries of treated females. Rpn6 was found to be the best target gene for both species tested, as its silencing resulted in reduced survival probability, decreased prolificacy in E. variegatus and altered egg and ovary maturation in S. titanus. This work highlights the potential of the RNAi mechanism as a control method for the vector insect vector S. titanus, although further effort is needed to develop appropriate delivery strategies for field conditions and to update legislation regarding the registration of dsRNA products.

Scaphoideus titanus è una cicalina di origine neartica ed è il principale vettore del fitoplasma della Flavescenza dorata, una delle malattie della vite più temute per il carattere epidemico e gli ingenti danni causati. Il patogeno è incluso nella lista A2 EPPO in quanto organismo di quarantena soggetto a lotta obbligatoria secondo normative nazionali. In Italia, infatti, vige l’obbligo di estirpo delle viti infette e di trattamento insetticida contro il vettore. L’impiego prolungato di prodotti insetticidi, spesso ad ampio spettro, comporta la perdita di biodiversità dell’entomofauna del vigneto e problemi alla salute degli operatori per l’esposizione ripetuta a tali sostanze. La richiesta di riduzione dell’utilizzo di prodotti chimici di sintesi per la salvaguardia dell’ecosistema da parte delle istituzioni europee ha determinato una forte spinta nella ricerca per lo sviluppo di numerose tecnologie alternative sostenibili, fra cui l’RNA interference (RNAi). Lo sfruttamento del meccanismo di RNAi per silenziare geni specifici del vettore consentirebbe di minimizzare gli effetti su insetti off-target dovuti all’uso di insetticidi convenzionali mantenendo un efficace controllo della popolazione target. Il presente studio è stato dedicato allo sviluppo di questa tecnica su S. titanus, vettore naturale, e su Euscelidius variegatus, vettore di laboratorio. La scelta dei potenziali geni target deriva da studi genome wide di altri gruppi di ricerca che hanno prodotto una lista di 11 geni, ritenuti bersagli promettenti per l’RNAi. Da questa lista sono stati selezionati tre target (eIF3a, PREB e Rpn6) che mostravano una bassa omologia di sequenza con l’ape da miele (Apis mellifera), scelta come rappresentante tra le specie dell’entomofauna da preservare. Sono stati quindi prodotti double-stranded RNAs (dsRNAs) complementari alle sequenze di S. titanus nelle regioni con minore similarità con ape e con maggiore omologia con E. variegatus, in modo tale da poter utilizzare le stesse molecole per entrambe le specie di vettori. Gli insetti adulti appena emersi sono stati microiniettati a livello addominale con una soluzione contenente dsRNAs e mantenuti su piante di avena (E. variegatus) o vite (S. titanus) per 21 giorni. Come controllo sono stati utilizzati dsRNAs complementari alla sequenza della Green Fluorescence Protein (GFP), assente in insetto. A 3, 7, 14 e 21 giorni dall’iniezione sono stati campionati individui per la valutazione degli effetti di silenziamento mediante RT-qPCR. Il tasso di mortalità è stato registrato quotidianamente. È stato inoltre analizzato l’effetto del silenziamento sulla quantità di progenie F1 ottenuta da individui di E. variegatus trattati e sulla fertilità di S. titanus, tramite osservazione al microscopio degli ovari delle femmine trattate. Rpn6 è risultato il gene target migliore per entrambe le specie testate, in quanto il suo silenziamento ha determinato una riduzione della probabilità di sopravvivenza, della prolificità di E. variegatus e un’alterata maturazione delle uova e degli ovari in S. titanus. Sebbene siano necessari ulteriori approfondimenti per sviluppare adeguate metodologie di somministrazione delle molecole in campo e aggiornamenti legislativi per quanto riguarda la registrazione dei prodotti a base di dsRNA, questo lavoro di tesi ha permesso di evidenziare l’efficacia e la buona potenzialità del meccanismo di RNAi come metodo di controllo per l’insetto vettore S. titanus.