Seed coating by electrospinning: a novel delivery method for Plant Growth Promoting Microorganisms

Over-fertilization and negative consequence from chemical fertilizers, particularly synthetic nitrogen-based ones, are estimated to cause about 10% of the global greenhouse gas emissions attributable to agriculture and other negative environmental consequences, such as water eutrophication and soil acidification, are also linked to massive use of chemical fertilizers and pesticides. In this context, the development of sustainable alternatives is a pressing challenge, including both the research of suitable substitutions, such as bacteria and fungi with biopesticide and biofertilizer activity (Plant Growth-Promoting Microorganisms, PGPMs), and the optimization of the methods for delivery of PGPMs, to improve their efficacy, scalability, and integration in agricultural and industrial systems and to ensure comparable results to the conventional chemical products. Seed coating techniques to deliver microbial inoculants to crops represent a promising approach. In this field, the use of advanced technologies to process formulations based on sustainable resources has recently shown great potential. To this end, this thesis work aims to coat seeds with a polymer matrix able to protect PGPMs from the external environment and ensure a gradual and continued release in the substrate. For this application, electrospinning (ESP) was selected, a technology which allows us to obtain nanofibrous membranes applying electrostatic forces to a polymer solution. In collaboration with the Department of Applied Science and Technology (DISAT) from the Polytechnic University of Turin (PoliTO), we developed a formulation based on a natural polymer, alginate (ALG) and a synthetic polymer, poly(ethylene oxide) (PEO), specifically optimized for processability via ESP. To understand the effect of the polymer matrix on plant development, two model crops of agronomical interest – rice (Oryza sativa) and tomato (Solanum lycopersicum) – were selected. The polymer formulation based on ALG and PEO (ALG-PEO) was used to coat the selected seeds by ESP and subsequently germination rate and plant morphometric parameters were monitored. Since the work mainly aimed at obtaining a membrane which could gradually release PGPMs over time, two bacteria known for their plant growth-promoting activity, Rahnella aquatilis and Bacillus sp., were selected for encapsulation by ESP in the fibrous membrane. The procedure was optimized by adding liquid culture of each bacterium to the ALG-PEO formulation to reach the final formulation (ALG-PEO-bacteria) for electrospinning. To monitor presence and viability of the microbial cells encapsulated in the membrane, molecular methods (PCR with species-specific primers) and confocal microscopy were used at different storage time points of the membrane. Finally, to understand the interactions between microorganisms and host plants, ALG-PEO-bacteria formulations were used for tomato seed coating by ESP. At the end of the plant growth period, isolation of microorganisms from the plants’ rhizosphere and endosphere were performed to determine the inoculum persistence when associated to the root compartments. Rhizosphere isolates, identified by Sanger sequencing, confirmed the presence of Bacillus sp., whereas endosphere isolates, identified by MALDI-TOF, confirmed the presence of Rahnella aquatilis. This work thus confirms that microbial inoculants can be processed by the selected technique and that the resulting membranes, used for seed coating, do not have negative effects on plant growth and development, thus allowing the inoculated PGPMs to persist for a long time in association with the plant.

L’impiego intensivo di fertilizzanti chimici azotati è responsabile di circa il 10% delle emissioni agricole globali di gas serra e contribuisce significativamente a problematiche ambientali quali l’eutrofizzazione delle acque e l’acidificazione dei suoli. In questo contesto, lo sviluppo di alternative sostenibili è una sfida sempre più rilevante e comprende sia l’individuazione di sostituti adatti, come batteri e funghi con funzione di biopesticidi e biofertilizzanti (Plant-Growth Promoting Microorganisms, PGPMs), sia l’ottimizzazione dei metodi di applicazione di PGPMs per migliorarne l’efficacia, la scalabilità e l’integrazione nel sistema agro-industriale e garantire prestazioni comparabili ai prodotti convenzionali. Un approccio promettente è la concia del seme per veicolare gli inoculi alle colture, ambito in cui tecnologie di fabbricazione avanzate per processare formulazioni a base di materie prime sostenibili hanno mostrato un notevole potenziale. Questo progetto di tesi si propone di rivestire il seme con una matrice polimerica in grado di proteggere i PGPMs dall’ambiente esterno e garantire un rilascio graduale e continuato nel mezzo di crescita. La tecnologia utilizzata è l’electrospinning (ESP), o elettrofilatura, che permette di ottenere membrane nanofibrose applicando forze elettrostatiche a una soluzione polimerica. In collaborazione con il Dipartimento Scienza Applicata e Tecnologia (DISAT) del Politecnico di Torino (PoliTO), si è sviluppata una formulazione a base di un polimero naturale, l’alginato (ALG), e un polimero sintetico, il poli(etilene ossido) (PEO), ottimizzata per poter essere processata mediante l’ESP. Per comprendere l’impatto della matrice polimerica sullo sviluppo della pianta sono state selezionate due specie modello di interesse agronomico, ovvero il riso (Oryza sativa) e il pomodoro (Solanum lycopersicum). La formulazione polimerica a base di ALG e PEO (ALG-PEO) è stata usata per rivestire i semi selezionati e successivamente si sono monitorati la percentuale di germinazione e i parametri morfometrici delle piante. Per valutare il potenziale della membrana di rilasciare in modo graduale i PGPMs sono stati selezionati due batteri noti per le loro capacità di plant growth promotion, Rahnella aquatilis e Bacillus sp., per essere incorporati durante il processo di ESP. La procedura è stata ottimizzata aggiungendo colture liquide di ciascun batterio alla formulazione ALG-PEO, al fine di ottenere la formulazione finale (ALG-PEO-batterio) per l’ESP. Per monitorare la presenza e sopravvivenza delle cellule microbiche incorporate nella membrana si sono usati metodi molecolari (PCR con primer specie-specifici) e di microscopia confocale, in diversi momenti della conservazione della membrana. Infine, per comprendere le interazioni tra i microrganismi e la pianta ospite, le formulazioni ALG-PEO-batterio sono state utilizzate per rivestire semi di pomodoro tramite l’ESP. Al termine del periodo di crescita delle piante sono stati effettuati isolamenti dalla rizosfera ed endosfera per determinare la permanenza dell’inoculo in associazione ai comparti radicali. Gli isolati dalla rizosfera, identificati tramite sequenziamento Sanger, hanno confermato la presenza di Bacillus sp., mentre tra gli isolati dell’endosfera, identificati tramite MALDI-TOF, è stata confermata la presenza di Rahnella aquatilis. Questo lavoro conferma dunque che gli inoculi microbici possono essere processati mediante l’ESP e che le membrane ottenute, utilizzate come rivestimento dei semi, non mostrano effetti negativi sulla crescita e sullo sviluppo della pianta, permettendo ai PGPMs di persistere a lungo in associazione con la pianta.